Superkritische vloeistofchromatografie (SFC) is een chromatografische scheidingstechniek waarbij een superkritisch fluïdum — in de praktijk vrijwel altijd koolstofdioxide (CO₂) — als mobiele fase fungeert. Boven het kritische punt van CO₂ (31,1 °C en 73,8 bar) verdwijnt de grens tussen vloeistof- en gasfase en ontstaat een homogene fase met een unieke combinatie van eigenschappen: de lage viscositeit en hoge diffusiviteit van een gas, gecombineerd met de dichtheid en oplosmiddelkracht van een vloeistof. Die combinatie maakt SFC sneller, milieuvriendelijker en in veel gevallen selectiever dan conventionele hogedruk vloeistofchromatografie (HPLC).
SFC wordt ingezet in de farmaceutische industrie, de voedingsanalyse, de petrochemie en het milieulaboratorium. De techniek heeft de afgelopen twee decennia een sterke opleving doorgemaakt, met name door de groeiende behoefte aan snelle chirale scheidingen en door de vervanging van toxische organische oplosmiddelen door CO₂.
Het werkingsprincipe van SFC is analoog aan dat van HPLC: het monster wordt via een injector in de mobiele fase gebracht, de componenten verdelen zich tussen de mobiele fase en de stationaire fase in de kolom, en elk component verlaat de kolom op een karakteristieke retentietijd. Het essentiële verschil ligt in de aard van de mobiele fase.
Superkritisch CO₂ heeft bij typische SFC-bedrijfsomstandigheden (35–60 °C, 100–400 bar) een dichtheid van 0,6–0,9 g/ml — vergelijkbaar met die van hexaan — en een viscositeit van 0,02–0,10 mPa s, ongeveer twintig maal lager dan water of typische HPLC-oplosmiddelen. Dit lage viscositeitsverschil resulteert in een aanzienlijk lagere drukval over de kolom bij gelijke doorstroomsnelheid, waardoor hogere vloeistofsnelheden mogelijk zijn zonder overmatige drukopbouw. De hoge diffusiviteit — 10 tot 100 maal groter dan in vloeistoffen — versnelt de massaoverdracht tussen mobiele en stationaire fase. Beide effecten samen zorgen voor kortere analysetijden en scherpere pieken dan in conventionele HPLC.
Puur superkritisch CO₂ is apolair en lost weinig polaire verbindingen op. Vrijwel alle moderne SFC-systemen voegen daarom een polaire modifier toe: een kleine hoeveelheid (1–40 vol%) organisch oplosmiddel, typisch methanol, ethanol of isopropanol. De modifier verhoogt de polariteit van de mobiele fase en verbetert de oplosbaarheid en retentie van polaire verbindingen. Via een modifiergradient — het geleidelijk verhogen van de modifierconcentratie tijdens de analyse — worden componenten met uiteenlopende polariteit efficiënt geëlueerd binnen één run, analoog aan een organisch gradient in omgekeerde-fase HPLC.
Naast de modifier kan een kleine hoeveelheid additief worden toegevoegd (0,05–1 vol% mierenzuur, ammoniak of ammoniumformiaat) om piekvormen van basische of zure verbindingen te verbeteren door ionische wisselwerking met de stationaire fase te onderdrukken.
Een kritisch onderdeel dat SFC onderscheidt van HPLC is de achterdrukregelaar (back pressure regulator, BPR). Deze klep wordt geplaatst na de detector en handhaaft een minimale systeemdruk boven het kritische punt van CO₂ (73,8 bar). Zonder BPR zou het CO₂ in de detectorcell expanderen naar de gasfase, wat tot luchtbellen, piekverbreding en detectieproblemen zou leiden. De systeemdruk is typisch ingesteld op 100–200 bar. Bij SFC-MS-koppelingen wordt de BPR vóór een splitter geplaatst, zodat een deel van het effluent naar de UV-detector en een deel naar de MS-ionenbron wordt geleid.
Een modern analytisch SFC-systeem bestaat uit de volgende componenten:
De stationaire fase is de primaire variabele voor selectiviteit in SFC. In vergelijking met HPLC worden in SFC meer diverse stationairefasecombinaties gebruikt, omdat superkritisch CO₂ een apolair oplosmiddel is dat eigenschappen heeft van normaal-fase modus. De meest gebruikte stationaire fasen zijn:
Silicagel (SIL). Polaire fase; retentie via H-bruggen en polaire interacties. Vroeger de meest gebruikte fase; nu verdrongen door modernere kolomtypen voor de meeste toepassingen. Nog steeds nuttig voor apolare verbindingen met weinig functionele groepen.
Gemodificeerde silicafasen. Diol-, aminopropyl-, cyano- (CN) en 2-ethylpyridine-fasen bieden een gevarieerd polariteitsprofiel. 2-Ethylpyridine (2-EP) is een populaire universele fase voor brede screening, met een combinatie van polaire en zwak basische interacties die goede piekvormen geeft voor zowel basische als zure verbindingen.
Omgekeerde-fase modificaties (C18, C8). Apolaire fasen zijn bruikbaar in SFC bij hogere modifierconcentraties, maar bieden minder chirale herkenning dan de typische SFC-fasen. Ze zijn geschikt voor de analyse van lipofiele verbindingen en lipiden.
Chirale stationaire fasen (CSP). Polysaccharide-derivaten — cellulose tris(3,5-dimethylphenylcarbamate) en amylose tris(3,5-dimethylphenylcarbamate) — zijn de dominante chirale fasen in SFC, exact dezelfde als in chirale HPLC. SFC is bijzonder geschikt voor chirale scheidingen omdat de lage viscositeit van de mobiele fase snelle analyse mogelijk maakt en de polaire modifier compatibel is met polysaccharidecoatings. Voor een uitgebreide behandeling van chirale selectoren, zie het artikel over chirale chromatografie.
Chirale SFC is de techniek van voorkeur in de farmaceutische industrie voor snelle bepaling van de enantiomere overmaat (ee) bij chirale werkzame stoffen. De enantiomere overmaat geeft aan in welke mate een mengsel uit één enantiomeer bestaat ten opzichte van het andere; bij geneesmiddelen is een hoge ee-waarde vereist omdat de twee enantiomeren sterk verschillende farmacologische en toxicologische profielen kunnen hebben. De analysetijden zijn twee tot vijf maal korter dan bij equivalent normaal-fase chirale HPLC, het oplosmiddelverbruik is aanzienlijk lager, en de piekvormen op polysaccharide-CSP's zijn doorgaans scherper. Een screeningsaanpak met 4–8 kolommen — cellulose en amylose CSP's in combinatie met methanol, ethanol en isopropanol als modifier — dekt de meerderheid van farmaceutische verbindingen. Chirale SFC wordt ingezet voor:
Buiten chirale toepassingen wordt SFC ingezet voor de analyse van lipofiele verbindingen die in omgekeerde-fase HPLC lange retentietijden en hoog oplosmiddelverbruik veroorzaken, zoals:
In de voedingsanalyse wordt SFC ingezet voor de bepaling van vetten en vetzuren, carotenoïden, tocofenolen, cholesterol en natural food colors. De snelheid en het lage organische oplosmiddelverbruik zijn hier praktische voordelen ten opzichte van normale-fase HPLC met hexaan. De koppeling van SFC met evaporatieve lichtverstrooiingsdetectie (ELSD) of een corona charged aerosol detector (CAD) biedt universele detectie voor lipiden zonder UV-absorptie.
SFC is geschikt voor de analyse van apolaire polymeren, wassen en paraffines. De diffusiviteit van superkritisch CO₂ verbetert de penetratie in poreuze polymeermatrices en versnelt de extractie van additieven en residumonomeren. SFC-MS is hier een waardevolle combinatie voor de identificatie van onbekende polymeeradditieven.
Polycyclische aromatische koolwaterstoffen (PAK's), pesticiden en vetzuurafgeleiden in milieu- en bodemmonsters worden geanalyseerd via SFC, al wordt hier in routinelaboratoria nog steeds vaker voor gaschromatografie gekozen vanwege de lagere instrumentkosten en brede norm-ondersteuning.
De koppeling van SFC aan een massaspectrometer (SFC-MS) is technisch uitvoerbaar en biedt selectiviteits- en identificatievoordelen. De BPR vormt hier een complicerende factor: vóór de MS-ionenbron moet het superkritische CO₂ worden geëxpandeerd naar de gasfase. In moderne SFC-MS-systemen wordt de BPR geplaatst vóór een splitter die een deel van het effluent naar de UV-detector leidt en het andere deel naar de MS. Electrospray-ionisatie (ESI) en atmosferisch druk chemische ionisatie (APCI) zijn beide compatibel met SFC-effluent. Voordelen van SFC-MS ten opzichte van LC-MS zijn:
Voor een uitgebreide behandeling van massaspectrometrische detectie in vloeistofchromatografie, zie het artikel over LC-MS en LC-MS/MS.
Preparatieve SFC wordt ingezet voor de isolatie van enantiomeren en andere componenten op gram- tot kilogramschaal, met name in de farmaceutische industrie. De techniek heeft hier duidelijke voordelen ten opzichte van preparatieve chirale HPLC:
Preparatieve SFC-systemen werken bij kolommen van 10 tot 50 mm interne diameter met vloeistofsnelheden van 50–500 ml/min CO₂. De fractieopvang vereist speciale ontgassers of koeltraps die het CO₂ vóór condensatie separeren van de modifier.
Een screeningsaanpak voor achirale SFC begint doorgaans met een set van vier tot zes kolommen met verschillende polariteiten (2-ethylpyridine, diol, CN, C18 en silicagel) en een vaste gradient van 5–40 vol% methanol in CO₂ in 5 minuten. Na de initiële screening worden de systeemparameters geoptimaliseerd:
Monsters voor SFC worden doorgaans opgelost in een oplosmiddel dat compatibel is met de mobiele fase: methanol, isopropanol of een mengsel van CO₂-modifier. Een hoge monsterconcentratie in sterk apolaire oplosmiddelen (hexaan, dichloormethaan) kan neerslag geven bij contact met de polaire modifier; dit wordt voorkomen door het monster op te lossen in de gebruikte modifier zelf. Filtratie over een 0,22 of 0,45 µm filter is standaard. Solid-phase extractie (SPE) wordt ingezet voor complexe matrices waarbij matrixcomponenten de kolom of detector kunnen verstoren.
UV-detectie via een diode-array detector (DAD) is de meest gebruikte detectiemethode bij analytische SFC. De transparantie van CO₂ voor UV-straling tot circa 210 nm is gunstig: er is geen UV-absorptie van het oplosmiddel zelf. Voor verbindingen zonder UV-absorptie (lipiden, suikers) zijn ELSD en CAD de standaarddetectoren. MS-koppeling biedt de hoogste selectiviteit en is essentieel voor identificatievraagstukken.
Superkritische vloeistofchromatografie (SFC) is een chromatografische scheidingstechniek waarbij een superkritisch fluïdum — vrijwel altijd CO₂ boven 31,1 °C en 73,8 bar — als mobiele fase dient, in combinatie met een polaire modifier (methanol, ethanol of isopropanol). SFC combineert de hoge diffusiviteit en lage viscositeit van een gas met de oplosmiddelkracht van een vloeistof, wat resulteert in snellere en milieuvriendelijkere scheidingen dan HPLC, in het bijzonder voor chirale verbindingen en lipofiele stoffen.
Een superkritisch fluïdum is een stof die zich boven haar kritische temperatuur én kritische druk bevindt. Boven dit kritische punt bestaat er geen onderscheid meer tussen vloeistof- en gasfase: de stof is homogeen en bezit gelijktijdig eigenschappen van beide fasen. Voor CO₂ ligt het kritische punt bij 31,1 °C en 73,8 bar. Boven dit punt is superkritisch CO₂ volledig mengbaar met organische oplosmiddelen, heeft het een instelbare dichtheid (en daarmee instelbare oplosmiddelkracht via druk- en temperatuurregeling) en gedraagt het zich als een uitstekend chromatografisch oplosmiddel. Beneden het kritische punt gedraagt CO₂ zich als een gewone vloeistof of als gas, afhankelijk van de condities, en zijn de gunstige SFC-eigenschappen afwezig.
CO₂ is de dominante keuze als mobiele fase in SFC om meerdere praktische en analytische redenen. Ten eerste heeft CO₂ een laag en gemakkelijk bereikbaar kritisch punt (31,1 °C, 73,8 bar), waardoor superkritische omstandigheden met standaard laboratoriumapparatuur haalbaar zijn. Ten tweede is CO₂ chemisch inert, niet ontvlambaar en aanzienlijk minder toxisch dan de organische oplosmiddelen die bij normaal-fase HPLC worden gebruikt, zoals hexaan. Ten derde is CO₂ UV-transparant tot circa 210 nm, zodat er geen achtergrondabsorptie is bij UV-detectie. Ten vierde is de dichtheid van superkritisch CO₂ continu instelbaar via druk en temperatuur, waardoor de oplosmiddelkracht van de mobiele fase tijdens een analyse precies kan worden bijgesteld zonder de chemische samenstelling te wijzigen. Na afloop van de analyse verdampt CO₂ volledig, wat fractiezuivering in preparatieve toepassingen aanzienlijk vereenvoudigt.
SFC maakt gebruik van kolommen die qua afmetingen vergelijkbaar zijn met HPLC-kolommen (3–25 cm lengte, 2–4,6 mm interne diameter, deeltjesgrootte 1,7–5 µm), maar de keuze van de stationaire fase verschilt wezenlijk. Omdat superkritisch CO₂ apolair is, werkt SFC in de normaal-fase modus: polaire stationaire fasen retineren polaire verbindingen sterker. De meest gebruikte kolomtypen zijn silicagel, gemodificeerde silicafasen (diol, aminopropyl, cyano, 2-ethylpyridine) en chirale stationaire fasen op basis van polysaccharide-derivaten (cellulose- en amylose-carbamaatcoatings). C18- en C8-kolommen zijn ook bruikbaar bij hogere modifierconcentraties, maar worden minder vaak ingezet. Voor chirale scheidingen zijn de polysaccharide-CSP's veruit het meest gangbaar en zijn zij compatibel met dezelfde kolommen die bij chirale HPLC worden gebruikt.
Zowel SFC als gaschromatografie (GC) scheiden verbindingen op basis van verdeling tussen een mobiele fase en een stationaire fase, maar de aard van de mobiele fase en de toepasbaarheid verschillen fundamenteel. Bij GC is de mobiele fase een inert draaggas (helium, stikstof of waterstof) en vindt scheiding plaats op basis van vluchtigheid en interactie met de stationaire fase bij hoge temperatuur (typisch 100–300 °C). SFC gebruikt superkritisch CO₂ als mobiele fase bij lage temperatuur (35–60 °C) en is daarmee geschikt voor thermisch labiele, niet-vluchtige en polaire verbindingen die bij GC-temperaturen ontleden of niet voldoende verdampen. Chirale scheidingen, lipiden en farmaceutische werkzame stoffen met functionele groepen worden doorgaans via SFC geanalyseerd; lichte vluchtige organische verbindingen en residuoplosmiddelen zijn het domein van GC.
Vloeistofchromatografie is de overkoepelende term voor alle chromatografische technieken waarbij een vloeibare mobiele fase wordt gebruikt. Hieronder vallen HPLC, UHPLC, omgekeerde-fase LC, normaal-fase LC, ionenchromatografie, affiniteitschromatografie, grootte-exclusiechromatografie en SFC. In SFC is de mobiele fase strikt genomen geen vloeistof maar een superkritisch fluïdum; de techniek gedraagt zich echter in het gebruik sterk als normaal-fase LC en wordt in de praktijk tot de familie van de vloeistofchromatografie gerekend.
Hogedruk vloeistofchromatografie (HPLC) is een variant van vloeistofchromatografie waarbij de mobiele fase met hoge druk (doorgaans 200–600 bar) door een kolom met fijn verpakt stationair-fasemateriaal wordt gepompt. SFC werkt op vergelijkbare drukken (100–400 bar), maar met CO₂ als hoofdcomponent van de mobiele fase in plaats van water of organische oplosmiddelen. HPLC is toepasbaar op een bredere klasse van polaire en ionische verbindingen; SFC heeft voordelen bij lipofiele, chirale en thermisch labiele verbindingen.
Drie eigenschappen zijn bepalend voor de chromatografische prestatie van een superkritisch fluïdum: (1) de lage viscositeit (0,02–0,10 mPa s), die hogere stroomsnelheden en lagere drukval mogelijk maakt; (2) de hoge diffusiviteit (10–100× groter dan in vloeistoffen), die de massaoverdracht tussen mobiele en stationaire fase versnelt en resulteert in hogere plaat-efficiënties bij hogere stroomsnelheden; en (3) de instelbare dichtheid (en daarmee oplosmiddelkracht) via druk en temperatuur, waarmee de polariteit van de mobiele fase geregeld wordt zonder de samenstelling te wijzigen. Samen verklaren deze drie eigenschappen de hogere analysetijdsnelheid en de flexibiliteit in methodeontwikkeling die SFC biedt ten opzichte van HPLC.
Superkritische vloeistofextractie (SFE) en SFC maken beide gebruik van superkritisch CO₂ als werkmedium, maar met een fundamenteel ander doel. Bij SFE (superkritische CO₂-extractie) wordt superkritisch CO₂ gebruikt om doelstoffen uit een vaste of vloeibare matrix te extraheren; de scheiding van componenten onderling vindt niet in de SFE-stap zelf plaats. Bij SFC vindt de daadwerkelijke chromatografische scheiding van componenten plaats in een kolom met superkritisch CO₂ als mobiele fase. SFE en SFC worden soms gecombineerd in een on-line koppeling, waarbij het SFE-extract direct op de SFC-kolom wordt geïnjecteerd zonder tussenliggende monstervoorbereiding.
Ja. De lage bedrijfstemperatuur van SFC (doorgaans 35–60 °C) maakt de techniek bij uitstek geschikt voor thermisch labiele verbindingen zoals terpenen, carotenoïden, vitaminen en bepaalde farmaceutische werkzame stoffen. Dit is een duidelijk voordeel ten opzichte van gaschromatografie, waarbij analystemperaturen van 150–300 °C gangbaar zijn.
UV-detectie en diode-array detectie (DAD) zijn de meest gebruikte detectiemethoden in SFC, omdat CO₂ UV-transparant is tot circa 210 nm. ELSD en CAD zijn de standaard voor verbindingen zonder UV-absorptie. MS-koppeling (SFC-MS) via ESI of APCI biedt selectieve en gevoelige detectie; de BPR dient dan vóór de MS-splitter te worden geplaatst. Vlam-ionisatiedetectie (FID) is technisch mogelijk maar vereist een speciale interface. Polarimetrische detectie wordt gebruikt bij chirale SFC voor informatie over de absolute configuratie.
SFC kent naast de genoemde voordelen ook praktische beperkingen die de toepasbaarheid begrenzen. Ten eerste is de techniek minder geschikt voor sterk polaire en ionische verbindingen — zoals aminozuren, nucleotiden en anorganische ionen — die in puur of gemodificeerd superkritisch CO₂ onvoldoende oplossen of elueren; voor die verbindingen biedt omgekeerde-fase HPLC of ionenchromatografie een betere oplossing. Ten tweede zijn de instrumentkosten hoger dan bij een vergelijkbaar HPLC-systeem, omdat een SFC-opstelling een gekoelde CO₂-pomp, een verwarmde mixer en een achterdrukregelaar vereist. Ten derde is een constante en kwalitatief hoogwaardige CO₂-levering (SFC-grade, N 4.5 of hoger) noodzakelijk; de logistiek rondom sifonflessen vraagt aanvullende organisatie ten opzichte van vloeistofgebaseerde HPLC. Ten slotte is het aantal gevalideerde en geaccepteerde normmethoden voor SFC in regelgevende omgevingen kleiner dan voor HPLC of GC, wat de implementatie in gereguleerde laboratoria kan vertragen.
Superkritisch CO₂ is chemisch inert en niet ontvlambaar, wat het veiliger maakt dan de ontvlambare organische oplosmiddelen die bij normaal-fase HPLC worden gebruikt. CO₂ is echter een verstikkend gas: bij lekkage in een slecht geventileerde ruimte kan de concentratie oplopen tot waarden die de zuurstofspanning verlagen en bewustzijnsverlies kunnen veroorzaken. In laboratoria waar SFC wordt toegepast, is een adequate ventilatie van de werkruimte en bij voorkeur een CO₂-detectiesysteem aan te bevelen. Daarnaast werkt een SFC-systeem bij hoge drukken (tot 400 bar); alle slangen, fittingen en onderdelen dienen gecertificeerd te zijn voor de gebruikte werkdruk en moeten periodiek worden geïnspecteerd. Het gebruik van SFC-grade CO₂ uit sifonflessen vereist de gebruikelijke voorzorgsmaatregelen voor persluchtcilinders: rechtop bewaren, vastketenen en beschermen tegen extreme temperaturen.
Een volledig SFC-systeem bestaat uit meer componenten dan een HPLC-systeem. De aanvullende eisen zijn:
Labvakhandel levert diverse verbruiksartikelen voor chromatografische toepassingen, waaronder chromatografievials, membraanfilters en spuitfilters voor monstervoorbereiding. Neem contact op voor advies over de juiste materialen voor uw SFC-toepassing.
Bekijk het assortiment laboratoriumapparatuur en verbruiksmaterialen van Labvakhandel, of neem contact op voor advies bij de keuze van de juiste materialen voor uw toepassing.
Disclaimer: De informatie in dit artikel is bedoeld als algemene technische toelichting. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl aanvaardt geen aansprakelijkheid voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische, klinische of industriële situaties. Raadpleeg voor uw eigen toepassing altijd de geldende normen, vakliteratuur en de documentatie van fabrikant en apparatuur.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
