Polarimetrie is de meettechniek waarmee de hoek wordt bepaald waarover een optisch actieve stof de trillingsrichting van vlak gepolariseerd licht draait. Elke verbinding met een asymmetrisch molecuul — en daarmee met chirale eigenschappen — bezit dit vermogen; de sterkte en richting van de draaiing zijn kenmerkend voor de stof, haar concentratie en de zuiverheid van het preparaat. In de farmacie, de levensmiddelenindustrie en de organische synthese is polarimetrie daarmee een snelle en niet-destructieve analysemethode voor identiteitsbepaling, concentratiemeting en chirale zuiverheidscontrole.
Een molecuul is optisch actief wanneer het niet samenvalt met zijn spiegelbeeld. Deze eigenschap heet chiraliteit. Het vermogen van een stof om gepolariseerd licht te draaien wordt ook aangeduid als het optisch rotatievermogen — een synoniem voor het specifiek draaivermogen [α] dat met name in oudere vakliteratuur en in farmacopee-monografieën voorkomt. De meest voorkomende oorzaak van chiraliteit is een asymmetrisch koolstofatoom — ook wel een stereogeen centrum genaamd: een koolstofatoom met vier verschillende substituenten — maar chiraliteit kan ook ontstaan door axiale asymmetrie (zoals bij bepaalde biarylen) of helicoïdale molecuulstructuren. De twee spiegelbeeldvormen van een chiraal molecuul heten enantiomeren. Beide vormen bezitten identieke fysische eigenschappen zoals smeltpunt en brekingsindex, maar draaien gepolariseerd licht in tegengestelde richting.
Het enantiomeer dat het licht rechtsom draait (met de klok mee, gezien in de richting van het licht) heet het (+)-enantiomeer of het d-enantiomeer (van dextrorotatory). Het enantiomeer dat het licht linksom draait heet het (−)-enantiomeer of l-enantiomeer (van levorotatory). Een gelijk mengsel van beide enantiomeren — een racemisch mengsel — is optisch inactief: de rotaties heffen elkaar op en de nettodraaiing is nul.
Gewoon licht bestaat uit elektromagnetische golven die in alle richtingen loodrecht op de voortplantingsrichting oscilleren. Een polarisator filtert al deze trillingsrichtingen op één na weg, zodat het doorgelaten licht uitsluitend in één vlak oscilleert: dit heet vlak gepolariseerd licht. Een optisch actieve stof roteert dit trillingsrichting over een hoek α, die de analysator achter het meetbuisje nauwkeurig bepaalt. Het principe van vlak gepolariseerd licht is daarmee de fysische basis van alle polarimetrische metingen.
In de optica worden drie vormen van gepolariseerd licht onderscheiden. Bij lineaire polarisatie oscilleert het elektrische veld in één vast vlak; dit is de vorm die in een polarimeter wordt gebruikt. Bij circulaire polarisatie roteert het elektrische veld tijdens de voortplanting met constante amplitude langs een cirkelbaan; links en rechts circulair gepolariseerd licht worden door chirale moleculen in verschillende mate geabsorbeerd, wat de basis vormt van circulair dichroïsme (CD). Bij elliptische polarisatie beschrijft het elektrische veld een ellips; dit is de meest algemene vorm en het werkingsprincipe van ellipsometrie voor diktemeting van dunne lagen.
Een polarimeter bestaat uit een lichtbron, een polarisator, een meetbuisje met het monster, een analysator en een detector. De lichtbron levert monochroom licht, klassiek de gele natrium-D-lijn bij 589,3 nm. De polarisator — doorgaans een Nicol-prisma (twee aan elkaar gelijmde calcietkristallen die op basis van totale interne reflectie alleen licht in één polarisatierichting doorlaten) of een polarisatiefilter — laat uitsluitend licht door dat in één vlak oscilleert: vlak gepolariseerd licht. Dit licht passeert het meetbuisje met de te onderzoeken oplossing. De optisch actieve stof in het buisje roteert het trillingsrichting over een hoek α. Achter het buisje bepaalt de analysator — een tweede polarisator die over precies die hoek α is verdraaid — de uitdovingspositie, en de detector leest de rotatiehoek af.
De gemeten rotatiehoek α hangt af van de concentratie van de optisch actieve stof, de buisjeslengte en de golflengte van het licht. Om verschillende metingen te kunnen vergelijken, heeft Jean-Baptiste Biot in de negentiende eeuw een genormaliseerde grootheid gedefinieerd: het specifiek draaivermogen [α]. De Biot-wet luidt:
[α]λT = α / (l × c)
Hierin is α de gemeten rotatiehoek in graden, l de buisjeslengte in decimeter en c de concentratie in gram per 100 ml oplossing. De bovenindex T geeft de temperatuur aan (standaard 20 °C) en de onderindex λ de golflengte (standaard 589 nm, aangeduid als D van de natrium-D-lijn). Het specifiek draaivermogen is daarmee een stofconstante, op te zoeken in handboeken en farmacopeeën, vergelijkbaar met de brekingsindex of het smeltpunt.
Het specifiek draaivermogen wordt uitgedrukt in graden·ml/(g·dm) en heeft een positieve waarde voor rechtsdraaiende en een negatieve waarde voor linksdraaiende verbindingen. Voor D-glucose geldt [α]D20 = +52,7°; voor L-fructose [α]D20 = −92,4°; voor L-menthol [α]D20 = −50°.
Polarimeters zijn beschikbaar in verschillende uitvoeringen, van handmatige visuele instrumenten tot volledig geautomatiseerde digitale apparaten.
Het meetbuisje (polarimeter tube) is in het laboratorium beschikbaar in standaardlengtes van 1 dm (100 mm), 2 dm en 0,5 dm. Een langere buis vergroot de rotatiehoek en verbetert de gevoeligheid bij laaggeconcentreerde oplossingen; een kortere buis is handig bij kleine monstervolumes of sterk gekleurde oplossingen. Het buisje moet vrij zijn van luchtbellen en moet schoon en optisch vlak zijn aan beide uiteinden. Troebele oplossingen worden vooraf gefiltreerd; voor polarimetriemetingen van suikerhoudende oplossingen worden klaarfilters van filterpapier of koolfiltratie gebruikt om de oplossing helder te maken zonder de concentratie te beïnvloeden.
De Europese Farmacopee (Ph. Eur.) en de United States Pharmacopeia (USP) schrijven voor talloze werkzame stoffen een grenswaarde voor het specifiek draaivermogen voor als identiteits- en zuiverheidskenmerk. Aminozuren, steroïden, alkaloïden en antibiotica bezitten vrijwel allemaal een kenmerkend specifiek draaivermogen. Een afwijkende meetwaarde duidt op verontreiniging, racemisatie of vervalsing. In de farmaceutische industrie is polarimetrie daarmee een standaard QC-methode die naast UV/Vis-spectrofotometrie en NMR-spectroscopie wordt ingezet.
In de suikerindustrie is polarimetrie — uitgevoerd met een sacharimeter — de primaire methode voor het bepalen van het sacharosegehalte in suikerriet, suikerbiet en eindproducten. De schaal in Internationale Suiker Graden (°Z) is direct gecalibreerd op sacharose-oplossingen. Een oplossing van 26 g sacharose in 100 ml water geeft bij 20 °C een aflezing van +100 °Z. De methode is genormeerd in ICUMSA (International Commission for Uniform Methods of Sugar Analysis) en vormt de basis van de handelsspecificaties voor ruwe en witte suiker.
Naast sacharose worden ook invertsuiker (een mengsel van glucose en fructose) en lactose polarimetrisch geanalyseerd. De inversie van sacharose door zuurhydrolyse leidt tot een karakteristieke draaiingsomkering — van rechtsdraaiend naar linksdraaiend — die direct meetbaar is. Dit is de basis van de inversietitratietechniek: door de rotatiewaarde vóór en na volledige hydrolyse te meten en het verschil te berekenen (de zogenoemde inversierotatiewaarde), kan het sacharosegehalte in complexe matrices zoals melasse of vruchtensap nauwkeurig worden bepaald, ook als andere optisch actieve componenten aanwezig zijn.
Een bijzonder aandachtspunt bij glucoseoplossingen is mutarotatie: verse oplossingen van D-glucose vertonen aanvankelijk een hoger specifiek draaivermogen (+112°) dan de evenwichtswaarde (+52,7°), omdat glucose in oplossing bestaat als een mengsel van α- en β-anomeren dat pas na verloop van tijd zijn evenwichtsverhouding bereikt. Voor betrouwbare polarimetrische glucosemetingen dient de oplossing eerst op kamertemperatuur te staan totdat het evenwicht is ingesteld, of worden ammoniaKsporen toegevoegd om het mutatrotatieproces te versnellen.
Bij de ontwikkeling en productie van enantiomeerzuivere geneesmiddelen is het vaststellen van de enantiomere overmaat (ee, enantiomeric excess) essentieel. Polarimetrie levert een snelle schatting: wanneer het specifiek draaivermogen van de zuivere stof bekend is, geeft de meetwaarde de ee direct:
ee (%) = ([α]gemeten / [α]zuiver enantiomeer) × 100
Voor nauwkeurige ee-bepalingen en voor de scheiding van enantiomeren wordt chirale chromatografie ingezet, waarbij een polarimetrische detector als on-line detector fungeert. Circulair dichroïsme (CD) is complementair aan polarimetrie: CD meet het verschil in absorptie van links en rechts circulair gepolariseerd licht en levert aanvullende structuurinformatie.
In de organische synthese dient polarimetrie voor het bewaken van stereoselectieve reacties. Bij asymmetrische synthesen — waarbij één enantiomeer bij voorkeur wordt gevormd — toont de tijdsafhankelijke polarimetrische meting het verloop van de reactie. Ook de kristallisatie van enantiomeerzuivere producten kan worden gevolgd door de rotatiewaarde van de moederloog te meten.
Een derde toepassingsgebied dat in de praktijk veel polarimetrische analyses genereert, zijn essentiële oliën en plantaardige vetten. D-limoneen — de dominante component in sinaasappelolie — heeft een karakteristiek specifiek draaivermogen van +125,6°; L-menthol in pepermuntolie geeft −50°; olijfolie heeft een kenmerkende negatieve rotatiewaarde die afwijkt bij versnijding met andere vetten. De Europese Farmacopee en internationale normen zoals de ISO 3513-methode voor citroenolie schrijven polarimetrie voor als identificatiemethode en als middel om vervalsing of kwaliteitsafwijkingen op te sporen. Ook in de analyse van vetzuren en triglycerides wordt het specifiek draaivermogen gebruikt als snel en niet-destructief identiteitscriterium.
Het specifiek draaivermogen is golflengteafhankelijk: bij kortere golflengten verandert de rotatie in het algemeen sterker. Dit verschijnsel heet optische rotatiedispersie (ORD). Een ORD-curve — de grafiek van [α] als functie van de golflengte — kan extra structuurinformatie geven, maar is minder diagnostisch dan een CD-spectrum. In de buurt van een absorptieband treedt het Cotton-effect op: een karakteristieke S-vormige afwijking in de ORD-curve waarbij de rotatiehoek vlak vóór de absorptiemaximum sterk stijgt en er direct achter sterk daalt (of omgekeerd). De richting en vorm van dit S-profiel zijn kenmerkend voor de absolute configuratie rondom het chiraal centrum en kunnen daarmee worden ingezet voor de toewijzing van R- of S-configuratie. In de moderne praktijk is circulair dichroïsme de methode van keuze voor structuuranalyse van eiwitten en nucleïnezuren, terwijl polarimetrie op 589 nm de standaard blijft voor routinematige concentratie- en identiteitsbepalingen.
Nauwkeurige polarimetrie vereist aandacht voor een aantal variabelen. De temperatuur heeft een directe invloed op het specifiek draaivermogen: voor de meeste verbindingen neemt [α] af bij stijgende temperatuur, typisch met 0,01 tot 0,05° per graad Celsius. Metingen worden standaard uitgevoerd bij 20 °C of bij de farmacopeetemperatuur van de monografie. Het oplosmiddel beïnvloedt de rotatie via specifieke interacties en moet identiek zijn aan het oplosmiddel gebruikt bij de referentiewaarde — in de farmacopee wordt water of ethanol voorgeschreven. De concentratie moet nauwkeurig worden bepaald omdat c direct in de berekening van [α] voorkomt; voor preparaten met een hoge zuiverheidsgraad worden de concentratie-eisen streng gesteld. Tot slot moet de oplossing volstrekt helder zijn: ook lichte troebeling veroorzaakt schijnrotatie door lichtverstrooiing.
Polarimeters worden gekalibreerd met gecertificeerde kwartsnormaalplaten of met standaardoplossingen van zuivere sacharose. De kwartsnormaalplaat heeft een vaste, temperatuuronafhankelijke rotatiewaarde die door de fabrikant is gecertificeerd. Methodevalidatie voor farmaceutisch gebruik voldoet aan de ICH Q2(R1)-richtlijn en omvat nauwkeurigheid, herhaalbaarheid, lineariteit en het aantonen van specificiteit; zie ook het artikel over validatie van analytische methoden.
Een polarimetrische detector kan on-line worden gekoppeld aan HPLC of superkritische vloeistofchromatografie (SFC) voor chirale analyse. In dit geval is de polarimetrische detector selectief voor optisch actieve verbindingen en geeft informatie over de absolute configuratie van de eluerende componenten. De koppeling van HPLC met een polarimetrische detector naast een UV-detector — aangeduid als HPLC-UV-Pol — biedt de mogelijkheid om de enantiomere verhouding direct uit het chromatogram te berekenen.
Bij Labvakhandel vindt u polarimeters en cuvetten voor polarimetrische metingen.
Disclaimer: De informatie in dit artikel is bedoeld als algemene technische toelichting. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl aanvaardt geen aansprakelijkheid voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische, klinische of industriële situaties. Raadpleeg voor uw eigen toepassing altijd de geldende normen, vakliteratuur en de documentatie van fabrikant en apparatuur.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
