Primers ontwerpen: regels, tools en bestelparameters voor PCR en klonering

Een primer is een kort stukje DNA dat bepaalt welk deel van het DNA een PCR vermenigvuldigt. Het ontwerp van de twee primers is daarmee de belangrijkste keuze die u vóór de reactie maakt: een slecht ontworpen primerpaar geeft geen product, een mengsel van producten of alleen primer-dimers, ook met het beste enzym en de beste thermocycler. In dit artikel leest u hoe u primers ontwerpt, welke regels voor lengte, smelttemperatuur en GC-gehalte gelden, welke gratis tools u gebruikt en waarop u let bij het bestellen.

PCR is in de praktijk geen enkele handeling maar een keten van technieken: DNA-isolatie, primerontwerp, de reactie zelf in de thermocycler en detectie van het product. Primerontwerp is de schakel waarin de meeste fouten ontstaan, en de enige die u volledig achter uw bureau kunt oplossen. Over de reactie en de keuze van het enzym leest u meer in het artikel over Taq-polymerase en PCR-master mix.

Wat is een primer en waarom heeft PCR er twee nodig?

Wat is een DNA-primer?

Een DNA-primer is een kort, enkelstrengs stukje DNA (een oligonucleotide) van meestal 18 tot 24 nucleotiden, dat complementair is aan een stuk van de template. Het polymerase kan een nieuwe streng alleen verlengen vanaf een bestaand 3′-uiteinde. De primer levert dat startpunt en bepaalt tegelijk de positie waar de synthese begint. Primers worden niet uit de natuur gehaald maar als maatwerk gesynthetiseerd, op basis van de basenvolgorde die u opgeeft.

Wat is het verschil tussen forward en reverse primers?

DNA bestaat uit twee strengen die in tegengestelde richting lopen. Een polymerase bouwt altijd in de richting 5′→3′. Om beide strengen te kopiëren zijn dus twee primers nodig, één voor elke streng:

• De forward primer bindt aan de onderste streng (de min-streng) en heeft dezelfde basenvolgorde als het begin van de bovenste streng. Het polymerase verlengt hem naar rechts, in de richting van de reverse primer.
• De reverse primer bindt aan de bovenste streng (de plus-streng) bij het einde van het doelfragment. Zijn basenvolgorde is het omgekeerde complement van de bovenste streng, gelezen van 5′ naar 3′. Het polymerase verlengt hem naar links.

Het stuk DNA tussen de twee primers, inclusief de primers zelf, is het amplicon: het product van de PCR.

Hoeveel primers heeft u nodig voor een PCR?

Een standaard-PCR gebruikt twee primers: een forward en een reverse primer. Bij Sanger-sequencing is één primer per reactie voldoende, zie het artikel over DNA-sequencing volgens Sanger. Isotherme methoden zoals LAMP gebruiken vier tot zes primers; zie isotherme amplificatiemethoden.

Waarom heeft DNA-polymerase een primer nodig?

Een DNA-polymerase kan geen nieuwe streng beginnen; het kan alleen nucleotiden aan een bestaand 3′-uiteinde koppelen. In de cel levert het enzym primase daarvoor een kort stukje RNA, bij PCR is dat de kunstmatige DNA-primer. Meer over de werking van het enzym staat in het artikel over Taq-polymerase.

Hoe ontwerpt u primers stap voor stap?

1. Zoek de doelsequentie op. Gebruik bij voorkeur een referentiesequentie met een accessienummer uit een publieke database, zodat u zeker weet welke versie van de sequentie u gebruikt.
2. Bepaal het gebied dat u wilt vermenigvuldigen. Kies de lengte van het amplicon op basis van uw toepassing (zie hieronder) en markeer de flankerende gebieden waarin de primers komen te liggen.
3. Stel de ontwerpcriteria in. Lengte, smelttemperatuur, GC-gehalte en amplicongrootte staan in de volgende sectie.
4. Laat een tool kandidaat-paren genereren. Primer3-gebaseerde tools doen dat in een paar seconden en rangschikken de paren op kwaliteit.
5. Controleer specificiteit en secundaire structuren. Laat de primers testen tegen het genoom van uw organisme en op hairpins en dimeren.
6. Bestel de primers en test ze. Draai een eerste PCR met een negatieve controle en controleer het product met gelelektroforese.

Welke ontwerpregels gelden voor een goede primer?

De richtwaarden verschillen enigszins per fabrikant en per toepassing. De tabel geeft de waarden die in de meeste handleidingen terugkomen, onder meer bij Addgene en New England Biolabs.

Hoe lang moet een primer zijn?

Voor de meeste toepassingen is 18 tot 24 nucleotiden een goede lengte. Een primer van minder dan ongeveer 18 basen bindt vaak op meerdere plaatsen in het genoom, een primer van meer dan 30 basen hybridiseert trager en vormt gemakkelijker secundaire structuren. Kloneringsprimers zijn langer omdat ze een 5′-uitloper met een restrictieplaats of overlap bevatten; zie DNA-klonering.

Wat is de smelttemperatuur (Tm) van een primer en hoe berekent u die?

De Tm is de temperatuur waarbij de helft van de primers aan de template gebonden is. Hij hangt af van de lengte, het GC-gehalte en de zoutconcentratie in de reactie, vooral het magnesium. Er bestaan drie manieren om de Tm te berekenen:

De uitkomsten verschillen sterk. Een primer van 22 nucleotiden met 12 G/C-basen komt met de Wallace-regel op 68 °C en met de basisformule op ongeveer 57 °C. Gebruik daarom voor beide primers dezelfde rekenmethode, en bij voorkeur de calculator van de leverancier van uw polymerase of buffer. Sommige high-fidelity polymerasen werken met hogere annealingtemperaturen dan Taq, en die calculators houden daar rekening mee.

Wat is een GC-clamp?

Een GC-clamp is een G of C aan het 3′-uiteinde van de primer, of een van beide in de laatste twee basen. Omdat G–C-paren sterker binden, verankert dit het uiteinde waar het polymerase begint. Overdrijf het niet: meer dan 3 G/C-basen in de laatste vijf posities verhoogt de kans op binding aan verkeerde plaatsen.

Hoe kiest u de annealingtemperatuur?

Begin ongeveer 5 °C onder de laagste Tm van het primerpaar en optimaliseer met een temperatuurgradiënt. De achtergrond en de optimalisatietips staan in het artikel over PCR en SNP-genotypering.

Hoe groot moet het PCR-product (amplicon) zijn?

Voor een standaard-PCR is 100 tot 1.000 bp een praktisch bereik. Voor qPCR kiest u 100 tot 200 bp, omdat korte producten efficiënter worden vermenigvuldigd; zie qPCR en real-time PCR. Voor klonering kan het product veel langer zijn, maar dan wordt een proofreading-polymerase belangrijker.

Hoe voorkomt u hairpins en primer-dimers?

Primers kunnen met zichzelf of met elkaar basenparen vormen. Dat kost primer en polymerase, en geeft vaak een heldere band onderaan de gel. Controleer elk kandidaat-paar op de volgende structuren:

Veel tools geven de stabiliteit van deze structuren weer als vrije energie (ΔG). Hoe negatiever de waarde, hoe stabieler de structuur en hoe groter het risico. Een hot-start polymerase vermindert de vorming van primer-dimers tijdens het pipetteren; zie het artikel over Taq-polymerase.

Hoe maakt u primers specifiek voor uw doelsequentie?

Een primer die op meerdere plaatsen bindt, geeft extra banden of een vals resultaat. Let daarom op het volgende:

• Controleer tegen het genoom. Laat de primers testen met een tool zoals Primer-BLAST, die zoekt naar andere bindingsplaatsen in het genoom van uw organisme.
• Let op verwante genen en pseudogenen. Leg de 3′-uiteinden van de primers in gebieden die verschillen van het verwante gen.
• Vermijd variatie onder de primer. Een SNP onder de primer, vooral aan het 3′-uiteinde, kan de binding verstoren en geeft dan een vals-negatief resultaat of allel-dropout.
• Overspan een intron voor cDNA. Wilt u mRNA meten zonder genomisch DNA mee te vermenigvuldigen, ontwerp dan een primer over de grens tussen twee exonen, of een primerpaar aan weerszijden van een intron.

Welke tools gebruikt u voor primerontwerp?

Niemand rekent primers volledig met de hand uit. De volgende gratis tools gebruiken allemaal een Primer3-achtig algoritme of vergelijkbare thermodynamische berekeningen:

De tools geven verschillende Tm-waarden omdat ze verschillende rekenmethoden en zoutcondities gebruiken. Gebruik voor een primerpaar altijd één tool, zodat de twee waarden vergelijkbaar blijven.

Hoe ziet een voorbeeld van een primerpaar eruit?

Het voorbeeld hieronder gebruikt een fictieve sequentie ter illustratie. De Tm is berekend met de basisformule; in uw eigen tool kan de waarde afwijken.

De reverse primer is niet de sequentie van de bovenste streng, maar het omgekeerde complement ervan. Eindigt het doelgebied op de bovenste streng met 5′-GCTTACGGATCTGCTCAAGGAC-3′, dan is de reverse primer 5′-GTCCTTGAGCAGATCCGTAAGC-3′. Veel ontwerpfouten ontstaan doordat deze stap vergeten wordt.

Waarin verschillen primers per toepassing?

Wat zijn degenerate primers?

Een degenerate primer is een mengsel van primers waarin op een of meer posities meerdere basen mogelijk zijn. U gebruikt ze als u het eiwit kent maar de exacte DNA-sequentie niet, of om verwante genen met dezelfde primers te vermenigvuldigen. Op die posities staan IUPAC-codes, zoals R (A of G), Y (C of T) en N (elke base). Hoe meer degeneratie, hoe lager de specificiteit.

Hoe bestelt u primers?

Primers worden als maatwerk gesynthetiseerd door een oligosynthese-leverancier en aan u geleverd als gevriesdroogd poeder. Bij het bestellen kiest u:

Hoe lost u gevriesdroogde primers op?

Centrifugeer het buisje kort voordat u het opent. Los het poeder op in water of in TE-buffer. Voor een stockoplossing van 100 µmol/l voegt u per nmol primer 10 µl toe: 25 nmol primer lost u dus op in 250 µl. Verdun de stockoplossing daarna tien keer tot een werkoplossing van 10 µmol/l, bijvoorbeeld 10 µl stock plus 90 µl water. In de reactie gebruikt u meestal een eindconcentratie van 0,2 tot 0,5 µmol/l; het opzetvoorbeeld staat in het artikel over Taq-polymerase.

Hoe controleert u of uw primers werken?

Controleer primers eerst op de computer en daarna in het laboratorium. Test de reactie altijd samen met een negatieve controle zonder template. De tabel koppelt de meest voorkomende problemen aan het primerontwerp:

Veelgestelde vragen

Kunt u dezelfde primers gebruiken voor PCR en qPCR?

Vaak wel, mits de primers aan de criteria voor qPCR voldoen, vooral een kort amplicon van 100 tot 200 bp. Valideer de efficiëntie van de primers met een standaardcurve.

Wat is het verschil tussen een primer en een probe?

Een primer is het startpunt voor het polymerase. Een probe is een oligonucleotide met een fluorescente label dat bij qPCR tussen de primers bindt en tijdens de reactie een signaal geeft. Een probe wordt niet verlengd.

Hoeveel primer gebruikt u per PCR-reactie?

Meestal een eindconcentratie van 0,2 tot 0,5 µmol/l per primer. Te veel primer verhoogt de kans op primer-dimers en aspecifieke producten.

Hoe bewaart u primers?

Bewaar de stockoplossing in porties bij −20 °C, zodat u de oplossing niet herhaaldelijk hoeft te ontdooien. Gevriesdroogde primers zijn bij −20 °C langdurig houdbaar; de exacte termijn staat bij de leverancier. Meer over opslag leest u in het artikel over koelen en vriezen in het lab.

Benodigde apparatuur en verbruiksartikelen voor primers en PCR

Voor het oplossen, verdunnen en bewaren van primers hebt u nauwkeurige pipetten nodig. Het correct pipetteren van kleine volumes is hierbij van groot belang. Bewaar de stockoplossingen in kleine buisjes in een vriezer.

Voor uw primerwerk levert Labvakhandel onder meer centrifugebuizen, pipetpunten, reagentia en kits voor moleculaire biologie en koel- en vriesapparatuur. Neem contact op voor advies over de juiste materialen voor uw toepassing.

Onderdeel van: Klinisch laboratorium

Disclaimer: De informatie in dit artikel is bedoeld als algemene technische toelichting. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl aanvaardt geen aansprakelijkheid voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische, klinische of industriële situaties. Raadpleeg voor uw eigen toepassing altijd de geldende normen, vakliteratuur en de documentatie van fabrikant en apparatuur.