Taq-polymerase is het hittebestendige enzym dat in de polymerasekettingreactie (PCR) nieuwe DNA-strengen opbouwt. Naast standaard Taq bestaan er hot-start varianten, proofreading-polymerasen en kant-en-klare master mixen waarin enzym, buffer, dNTP's en magnesium al zijn gecombineerd. Let op: PCR is in de praktijk een keten van technieken (isolatie, primerontwerp, de reactie zelf, detectie), zoals de tabel hieronder laat zien. In dit artikel leest u wat een DNA-polymerase doet, waarin deze varianten verschillen en hoe u de juiste keuze maakt voor uw toepassing, van routine-PCR tot DNA-klonering.
De PCR-reactie zelf is één techniek: een polymerase kopieert DNA in herhaalde temperatuurcycli. Een PCR-analyse in het laboratorium is echter een keten van meerdere technieken, en elke schakel bepaalt of het eindresultaat klopt. Een fout vooraf, bijvoorbeeld een slecht primerontwerp of vervuild template, kunt u achteraf niet met een betere thermocycler herstellen.
Dit artikel richt zich op stap 4 en de keuze van enzym en master mix. De stappen ervoor en erna komen elk in hun eigen artikel aan bod.
Taq-polymerase is een DNA-polymerase uit de bacterie Thermus aquaticus, die leeft in warme bronnen. Het enzym is tegen hoge temperaturen bestand: het blijft actief na herhaald verhitten tot circa 95 °C en werkt het snelst bij ongeveer 72–80 °C. Daardoor hoeft er na elke denaturatiestap geen vers enzym te worden toegevoegd, en dat maakte de automatische PCR in een thermocycler mogelijk. Meer achtergrond over het enzym vindt u op Wikipedia.
Taq is de afkorting van Thermus aquaticus en wordt in het laboratorium gebruikt voor het enzym Taq-polymerase of Taq DNA-polymerase. De naam komt ook voor in TaqMan: een qPCR-methode met een fluorescente probe die door de 5′→3′-exonucleaseactiviteit van Taq wordt afgebroken, waardoor een signaal ontstaat.
DNA-polymerase is een enzym dat nucleotiden aan elkaar koppelt tot een nieuwe DNA-streng, met een bestaande DNA-streng als mal (template). In de cel zorgt DNA-polymerase voor de verdubbeling van het DNA vóór celdeling en voor het herstel van DNA-schade. In het laboratorium gebruikt u het enzym om DNA te vermenigvuldigen (PCR), om DNA te sequencen (Sanger-methode) en om DNA te labelen. Hoe de replicatie in de cel verloopt, leest u in het artikel over DNA-klonering.
DNA-polymerase leest de templatestreng in de richting 3′→5′ en bouwt de nieuwe streng op in de richting 5′→3′. Het enzym kan alleen nucleotiden aan een vrij 3′-uiteinde koppelen en kan niet zelfstandig een nieuwe streng starten. Daarom is altijd een primer nodig.
Dat stukje heet de RNA-primer. In de cel wordt het gemaakt door het enzym primase. Bij PCR neemt een kunstmatig gemaakte DNA-primer (een oligonucleotide) deze rol over; de twee primers bepalen welk stuk DNA wordt vermenigvuldigd.
Dit proces heet transcriptie. RNA-polymerase bindt aan een promotor, opent de DNA-helix lokaal en bouwt een RNA-streng op die complementair is aan de templatestreng, waarbij uracil (U) het thymine (T) vervangt. Bij een eukaryote cel wordt het ruwe RNA daarna nog bewerkt (splicing) voordat het als mRNA de celkern verlaat. Wilt u RNA in een PCR gebruiken, dan moet het eerst met reverse transcriptase worden overgeschreven naar cDNA; zie qPCR en RT-qPCR.
De keuze van het enzym bepaalt de nauwkeurigheid, de specificiteit en de maximale lengte van het product. De tabel geeft de belangrijkste typen weer.
Bij een gewone Taq-reactie kan het enzym al tijdens het pipetteren, bij kamertemperatuur, primers aan verkeerde plaatsen verlengen of primer-dimers vormen. Hot-start Taq is zo gemaakt dat het enzym pas actief wordt na een eerste verhittingsstap (meestal 2–15 minuten bij 95 °C). De blokkade is bijvoorbeeld een gebonden antilichaam, een chemische modificatie of een aptameer. Het resultaat is een zuiverder product en een hogere opbrengst, vooral bij weinig template. Let op de activeringstijd van de fabrikant, want die verschilt per type.
Een proofreading-polymerase heeft een 3′→5′-exonucleaseactiviteit waarmee het een verkeerd ingebouwd nucleotide verwijdert en vervangt. Dat verlaagt het aantal fouten sterk. Voor een genotyperingstest of een kolonie-PCR hoeft dat niet, voor een gen dat u gaat klonen en tot expressie wilt brengen wel. De meeste proofreading-enzymen maken blunt-end producten; voor TA-kloneren moet u dan achteraf een A-overhang toevoegen.
Een PCR-master mix is een kant-en-klaar mengsel van polymerase, reactiebuffer, magnesium en dNTP's, meestal geleverd als 2x of 5x concentraat. U voegt alleen primers, template en water toe. Dat scheelt pipetteerhandelingen, verkleint de kans op pipetteerfouten en geeft een betere reproduceerbaarheid tussen reacties en tussen medewerkers.
De samenstelling verschilt per fabrikant, maar een 2x master mix bevat doorgaans:
Sommige master mixen bevatten een of meer kleurstoffen en een verzwaringsmiddel, waardoor u het reactiemengsel na de PCR direct op een agarosegel kunt laden. Dat bespaart een stap bij gelelektroforese. Voor fluorescentiemetingen in een real-time PCR gebruikt u een master mix zonder dergelijke kleurstoffen, tenzij de fabrikant aangeeft dat deze geschikt is.
Begin bij het doel van uw PCR:
De activiteit van een polymerase wordt in units (U) opgegeven. Een veelgebruikte definitie is de hoeveelheid enzym die in 30 minuten bij 74 °C 10 nmol dNTP in zuurprecipiteerbaar materiaal inbouwt, maar de definitie verschilt per fabrikant. Daarom zijn units van verschillende merken niet zonder meer vergelijkbaar. Controleer altijd de datasheet, en gebruik bij een nieuw merk de aanbevolen hoeveelheid van de fabrikant, vaak in de orde van 0,5–2,5 U per reactie van 50 µl.
Het voorbeeld hieronder geldt voor een reactie van 25 µl met een 2x master mix. Gebruik altijd de aanwijzingen van de fabrikant als uitgangspunt.
Pipetteer bij voorkeur op ijs of in een gekoeld blok, en maak voor meerdere reacties eerst een gezamenlijk mengsel van master mix, primers en water, zodat u per buisje alleen nog het template toevoegt. Een negatieve controle zonder template (NTC) controleert op contaminatie. Het temperatuurprofiel, de annealingtemperatuur en optimalisatietips vindt u in het artikel over PCR en SNP-genotyping. Controleer het product daarna met gelelektroforese.
Primers zijn korte, enkelstrengs DNA-stukjes van gewoonlijk 18–24 nucleotiden die u zelf ontwerpt op de sequentie van uw doel. Ze worden als maatwerk (custom oligonucleotide) gesynthetiseerd en geleverd als gevriesdroogd poeder, dat u oplost in water of TE-buffer tot een stockoplossing van bijvoorbeeld 100 µmol/l en daarna verdunt tot 10 µmol/l. Let bij het ontwerp op de smelttemperatuur van beide primers (die moet dicht bij elkaar liggen), op het GC-gehalte, en op zelfcomplementariteit en primer-dimers. Wilt u het product klonen, dan voegt u aan de 5′-kant de restrictieplaatsen of overlappende sequenties toe; dat staat beschreven in het artikel over DNA-klonering. Bewaar de stockoplossing in porties bij −20 °C.
Bewaar polymerasen en master mixen bij −20 °C, bij voorkeur in een vriezer zonder automatische ontdooicyclus, omdat de temperatuur in een no-frost vriezer periodiek oploopt. Het glycerol in de buffer zorgt ervoor dat het enzym bij −20 °C vloeibaar blijft. Verdeel een nieuwe master mix in porties om herhaald invriezen en ontdooien te beperken, en houd het enzym tijdens het werk op ijs of in een gekoeld blok. Meer over de keuze van apparatuur leest u in het artikel over koelen en vriezen in het lab.
Zie voor meer optimalisatietips het artikel over PCR en SNP-genotyping. Het correct pipetteren van kleine volumes is hierbij van groot belang.
PCR staat voor polymerase chain reaction (polymerasekettingreactie). Het is een techniek waarmee een specifiek stuk DNA in enkele uren miljarden keren wordt gekopieerd. Daarvoor zijn template-DNA, twee primers, dNTP's, een hittebestendig DNA-polymerase zoals Taq, een buffer met magnesium en een thermocycler nodig.
Een PCR-cyclus bestaat uit denaturatie (circa 95 °C, de strengen gaan uit elkaar), annealing (circa 55–65 °C, de primers binden) en extensie (circa 72 °C, Taq bouwt de nieuwe streng op). Deze cyclus wordt 25 tot 40 keer herhaald.
Bij gewone PCR bekijkt u het product na afloop, bijvoorbeeld op een gel. Bij qPCR (real-time PCR) meet het apparaat tijdens elke cyclus een fluorescentiesignaal, zodat u de hoeveelheid doel-DNA kunt bepalen. Lees meer in het artikel over qPCR en real-time PCR en over digitale PCR.
Taq-polymerase is alleen het enzym. Een master mix bevat naast het enzym ook de buffer, het magnesium en de dNTP's in een vaste verhouding. Met losse Taq bepaalt u zelf de samenstelling, met een master mix werkt u sneller en reproduceerbaarder.
Standaard Taq is bij kamertemperatuur al deels actief en kan aspecifieke producten vormen tijdens het pipetteren. Hot-start Taq blijft geblokkeerd tot de eerste verhitting en geeft daardoor een specifieker product, vooral bij weinig template.
Voor een PCR hebt u een PCR-machine (thermocycler), nauwkeurige pipetten met filterpunten en reactiebuisjes of platen nodig. Een gekoeld blok voor PCR-buisjes houdt enzym en master mix tijdens het pipetteren koud. Na de PCR controleert u het product met een elektroforesesysteem.
Voor uw PCR-werk levert Labvakhandel onder meer PCR-tubes, pipetpunten, reagentia en kits voor moleculaire biologie en apparatuur voor biotechnologie en moleculaire biologie. Neem contact op voor advies over de juiste materialen voor uw toepassing.
Onderdeel van: Klinisch laboratorium
Disclaimer: De informatie in dit artikel is bedoeld als algemene technische toelichting. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl aanvaardt geen aansprakelijkheid voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische, klinische of industriële situaties. Raadpleeg voor uw eigen toepassing altijd de geldende normen, vakliteratuur en de documentatie van fabrikant en apparatuur.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
