DNA-klonering, ook wel moleculair klonen genoemd, is de techniek waarmee een laboratorium een bepaald stuk DNA of gen in grote hoeveelheden en in identieke kopieën maakt. Het DNA-fragment wordt in een vector gebouwd, meestal een plasmide, en in een gastheer gebracht, meestal de bacterie Escherichia coli. Elke keer dat de bacterie zich deelt, wordt het ingebouwde DNA mee gekopieerd. Zo ontstaat uit één molecuul binnen een nacht een kweek met miljarden kopieën. Dit artikel legt eerst de basis van DNA en DNA-replicatie uit en behandelt daarna de stappen, methoden, controles en valkuilen van klonering.
Klonering betekent het maken van een genetisch identieke kopie. In het laboratorium gaat het meestal om moleculair klonen: het kopiëren van DNA met behulp van enzymen en bacteriën. Dit is iets anders dan het klonen van een heel dier, zoals bij het schaap Dolly; daarover leest u meer verderop.
Een kloon (Engels: clone) is een kopie van een DNA-fragment, een cel of een heel organisme die genetisch gelijk is aan het origineel. Een bacteriekolonie op een agarplaat is bijvoorbeeld een kloon: alle cellen stammen af van één cel.
Klonen betekent het maken van een genetisch identieke kopie. De gebruikelijke Nederlandse spelling is klonen en kloon; de spelling met c volgt het Engelse clone en komt in teksten ook voor.
DNA (deoxyribonucleïnezuur) is het molecuul dat de erfelijke informatie van een cel bevat. Het bestaat uit twee strengen die om elkaar heen gewikkeld zijn tot een dubbele helix. Elke streng is opgebouwd uit nucleotiden en elk nucleotide bestaat uit een suikergroep (deoxyribose), een fosfaatgroep en een stikstofbase.
De vier bouwstenen van DNA zijn de nucleotiden met de basen adenine (A), thymine (T), guanine (G) en cytosine (C). De twee strengen worden bij elkaar gehouden door waterstofbruggen tussen de basen: A paart altijd met T (twee waterstofbruggen) en G paart altijd met C (drie waterstofbruggen). Daardoor bevat elke streng alle informatie van de andere: de strengen zijn complementair. De volgorde van de basen, de sequentie, bepaalt de genetische informatie.
In menselijke cellen zit het merendeel van het DNA in de celkern, verdeeld over 46 chromosomen. Een klein deel zit in de mitochondriën. Rode bloedcellen hebben geen celkern en bevatten dus geen kern-DNA. Bacteriën hebben geen celkern: hun DNA ligt in het cytoplasma, vaak aangevuld met kleine ringvormige stukjes DNA, de plasmiden. Die plasmiden spelen de hoofdrol bij klonering.
Een menselijke cel bevat ongeveer 3,1 tot 3,2 miljard basenparen per set chromosomen, dus ongeveer 6,4 miljard basenparen per diploïde cel. De afstand tussen twee opeenvolgende basenparen is ongeveer 0,34 nm. Uitgerekt komt het DNA van één menselijke cel daarmee op ongeveer twee meter. Een plasmide dat voor klonering wordt gebruikt is veel kleiner: meestal enkele duizenden basenparen (enkele kb).
RNA (ribonucleïnezuur) verschilt op drie punten van DNA. RNA is meestal enkelstrengs, het bevat de suiker ribose in plaats van deoxyribose en het bevat de base uracil (U) in plaats van thymine. RNA wordt gemaakt van het DNA en vervult daarna verschillende rollen in de cel.
De drie hoofdtypen RNA zijn boodschapper-RNA (mRNA, de kopie van een gen die als bouwtekening voor een eiwit dient), transfer-RNA (tRNA, dat aminozuren aanvoert) en ribosomaal RNA (rRNA, een bestanddeel van het ribosoom waar eiwitten worden gemaakt). Daarnaast bestaan er veel kleinere regulerende RNA's, zoals microRNA. Voor het isoleren en analyseren van RNA zie het artikel over RNA-isolatie en RNA-analyse.
DNA-replicatie is het proces waarbij een cel haar DNA verdubbelt. Daarbij dient elke bestaande streng als template (mal) voor een nieuwe, complementaire streng. Het resultaat is twee identieke dubbelstrengs-moleculen, die elk uit één oude en één nieuwe streng bestaan. Dit heet semiconservatieve replicatie. In het lab maakt de bacterie bij klonering gebruik van precies dit proces: het plasmide wordt gerepliceerd tijdens de celdeling.
Voor een celdeling moet de cel eerst haar complete genoom kopiëren, zodat beide dochtercellen dezelfde erfelijke informatie krijgen. Zonder replicatie zijn groei, weefselherstel en voortplanting van cellen niet mogelijk.
Het nut van DNA-replicatie is dat erfelijke informatie betrouwbaar wordt doorgegeven bij elke celdeling. Het kopiëren van DNA door een polymerase is ook de basis van laboratoriumtechnieken als de polymerasekettingreactie (PCR) en klonering.
Bij cellen met een kern vindt DNA-replicatie plaats in de S-fase (synthesefase) van de interfase, voorafgaand aan de mitose of meiose. Bij bacteriën is het proces niet aan een vaste celcyclusfase gebonden: replicatie start bij de oorsprong van replicatie (ori) en loopt vooruit op de celdeling.
Tijdens DNA-replicatie wordt de dubbele helix geopend en wordt elke streng als mal gebruikt voor een nieuwe, complementaire streng. Het resultaat is twee identieke dubbelstrengs-moleculen.
De cel doorloopt vier opeenvolgende stappen:
De belangrijkste enzymen zijn helicase (opent de helix), topo-isomerase (neemt de spanning in het DNA weg), primase (maakt de RNA-primer), DNA-polymerase (bouwt de nieuwe streng) en DNA-ligase (verbindt fragmenten). Enkelstrengs-bindende eiwitten houden de geopende strengen uit elkaar. Twee van deze enzymen zijn ook de gereedschappen van de klonering: DNA-polymerase (bij het amplificeren van het insert) en DNA-ligase (bij het inbouwen in de vector).
Ja. Een DNA-polymerase bouwt een nieuwe streng altijd op in de richting 5'→3': nieuwe nucleotiden worden aan het 3'-uiteinde gekoppeld. De template-streng wordt daarbij in de richting 3'→5' afgelezen.
Een sequentie wordt standaard van 5' naar 3' genoteerd. Wilt u de complementaire streng aflezen, vervang dan elke base door zijn complement (A↔T, G↔C) en draai de volgorde om. De sequentie 5'-ATGC-3' hoort bij de complementaire streng 5'-GCAT-3' (de zogenaamde reverse complement).
Bij replicatie wordt het volledige genoom één keer per celdeling gekopieerd naar DNA, met DNA-polymerase en een RNA-primer. Bij transcriptie wordt alleen een gen of groep genen gekopieerd naar RNA door RNA-polymerase. RNA-polymerase heeft geen primer nodig en kan een gen meerdere keren achter elkaar overschrijven. Het product van replicatie is dus DNA, het product van transcriptie is RNA.
DNA-synthese is het opbouwen van een nieuwe DNA-streng. Dat kan biologisch gebeuren door een DNA-polymerase (replicatie en PCR), maar ook chemisch: oligonucleotiden zoals primers worden in het laboratorium base voor base chemisch gesynthetiseerd.
Replicatie betekent letterlijk het herhalen of kopiëren. In de biologie is het het verdubbelen van het DNA voorafgaand aan een celdeling.
Voor klonering zijn vier onderdelen nodig: het DNA dat u wilt kopiëren (het insert), een vector, enzymen om te knippen en te plakken en een gastheer.
Het insert is het DNA-fragment dat gekloneerd wordt: een gen, een regulerend element of een willekeurig stuk DNA. Het wordt meestal verkregen met een polymerasekettingreactie (PCR) op een template, of door uit een ander plasmide of genomisch DNA te knippen. Het insert wordt vaak opgezuiverd uit een agarosegel.
Een plasmide is een klein, ringvormig DNA-molecuul dat zich los van het bacteriële chromosoom kan vermenigvuldigen. Een kloneringsvector bevat meestal vier elementen:
Restrictie-enzymen zijn enzymen uit bacteriën die DNA knippen op een specifieke herkenningssequentie van meestal 4 tot 8 basenparen. Deze sequenties zijn vaak palindromisch: ze lezen op beide strengen hetzelfde van 5' naar 3'. Het enzym EcoRI herkent bijvoorbeeld GAATTC en knipt tussen de G en de A. Daardoor ontstaan korte, enkelstrengs uiteinden van vier basen die complementair zijn aan elkaar: kleverige uiteinden (sticky ends). Andere enzymen, zoals SmaI, knippen recht door beide strengen en laten stompe uiteinden (blunt ends) achter.
T4 DNA-ligase verbindt het 3'-hydroxy-uiteinde van de ene streng aan het 5'-fosfaat-uiteinde van de andere streng, onder verbruik van ATP. Zo ontstaat een gesloten, recombinant plasmide. Kleverige uiteinden worden efficiënter geligeerd dan stompe uiteinden, omdat de complementaire overhangen elkaar vasthouden totdat het ligase de binding sluit.
Als gastheer wordt meestal een laboratoriumstam van E. coli gebruikt. Zulke stammen groeien snel, zijn goed te manipuleren en zijn zo aangepast dat ze het plasmide stabiel vasthouden. Voor kweek op agarplaten en in vloeibaar medium is een microbiologisch kweekmedium nodig, en een steriele werkwijze volgens de principes van aseptische techniek.
Een DNA-klonering verloopt in vijf stappen. Het stappenplan hieronder is het klassieke knippen en plakken met restrictie-enzymen.
Voor het bewaren en bijhouden van een geslaagde kloon wordt vaak een glycerolstock gemaakt en ingevroren, zodat de kloon later opnieuw te kweken is. Een uitgebreid protocol voor PCR-klonering staat bij Addgene, en een Nederlandstalige introductie op Wikipedia.
Het klassieke knippen en plakken met restrictie-enzymen is de meest gebruikte methode, maar niet de enige. Welke methode het beste past hangt af van het aantal fragmenten, de grootte van het construct en het gewenste resultaat.
Het TA-kloneren sluit direct aan op de eigenschappen van het polymerase. Welk polymerase u voor welke toepassing kiest, leest u in het artikel over Taq-polymerase, hot-start en PCR-master mix.
De primers die het insert vermenigvuldigen bepalen ook hoe het insert in de vector past. Daarom bestaan kloneringsprimers uit twee delen: een 3'-deel dat aan het template bindt (meestal 18 tot 25 basen) en een 5'-uitloper met de herkenningsplaats van het restrictie-enzym. Voor een efficiënte digestie worden voor de herkenningsplaats vaak een paar extra basen toegevoegd, omdat veel enzymen slecht knippen vlak aan het uiteinde van een DNA-fragment. Controleer verder of de gekozen herkenningsplaatsen niet ook binnen het insert voorkomen, en of het leesraam van het gen in de vector behouden blijft. Gebruik voor PCR-producten die later gesequenced of tot expressie gebracht worden bij voorkeur een polymerase met proofreading, omdat standaard Taq-polymerase relatief meer fouten maakt.
Blauw-wit screening maakt het mogelijk om kolonies met een vector zonder insert en kolonies met een recombinant plasmide al op de plaat van elkaar te onderscheiden. Veel kloneringsvectoren bevatten een stukje van het lacZ-gen (lacZα), met de multiple cloning site in het gen. De gastheerstam levert het ontbrekende deel van het enzym β-galactosidase. Samen vormen ze een werkend enzym. Het volgende gebeurt op de plaat:
Witte kolonies zijn dus kandidaten voor een recombinant plasmide, maar niet zonder meer bewezen. Controleer ze altijd met kolonie-PCR, digestie of sequencing. De concentraties van IPTG en X-Gal en de te gebruiken gastheerstam staan in de documentatie van de vector.
Het plasmide wordt uit een kweek opgezuiverd met een plasmide-isolatie. Zie DNA-isolatie en DNA-extractie voor de achtergrond.
DNA verandert van nature door mutaties, bijvoorbeeld door fouten bij replicatie of door UV-straling en chemische stoffen. Opzettelijk aanpassen gebeurt in het laboratorium met technieken als klonering en genoombewerking. Bij mensen is somatische gentherapie, waarbij het DNA van lichaamscellen van een patiënt wordt aangepast, onder strenge voorwaarden toegestaan. Het veranderen van erfelijk materiaal in embryo's is in Nederland verboden. Zie voor het wettelijke kader het artikel over CRISPR-Cas9.
Bij DNA-klonering wordt een stuk DNA gekopieerd in bacteriën of cellen. Bij reproductief klonen wordt een volledig organisme gemaakt dat genetisch identiek is aan een donor. Dat gebeurt meestal met celkerntransplantatie: de celkern van een lichaamscel van de donor wordt in een eicel gebracht waaruit de eigen kern is verwijderd. Die eicel ontwikkelt zich tot een embryo, dat door een draagmoeder wordt uitgedragen. Het schaap Dolly (geboren in 1996) was het eerste zoogdier dat op deze manier uit een cel van een volwassen dier werd gekloond.
Het klonen van dieren werkt via celkerntransplantatie, zoals hierboven beschreven. Het proces heeft een lage slagingskans en vraagt veel eicellen en draagmoeders.
Ja. Het klonen is gelukt bij onder meer schapen, koeien, muizen en honden. De eerste gekloonde hond, Snuppy, werd in 2005 geboren in Zuid-Korea.
Ja, klonen is mogelijk. DNA-klonering is een standaardtechniek in elk moleculair-biologisch laboratorium en dieren zijn met celkerntransplantatie gekloond. Het klonen van mensen is ethisch omstreden en in veel landen verboden.
Ja. Gekloonde dieren zijn gemaakt en klonen komen ook van nature voor, bijvoorbeeld eeneiige tweelingen, planten die uit stekken groeien en bacteriën die zich delen.
Technisch is celkerntransplantatie bij zoogdieren, ook bij apen, gelukt. Reproductief klonen van mensen is ethisch omstreden en in veel landen verboden.
Er is nooit wetenschappelijk bevestigd dat een mens is gekloond. Claims daarover zijn niet onderbouwd.
Het klonen van mensen is in Nederland verboden op grond van de Embryowet. Onderzoek aan DNA-klonering in bacteriën en cellen valt hier niet onder en is gewoon toegestaan binnen de regels voor genetisch gemodificeerde organismen (zie verderop).
Nee, in Nederland niet. Ook internationaal wordt reproductief klonen van mensen in veel landen niet toegestaan.
Klonen is een vorm van ongeslachtelijke voortplanting: er is slechts één ouder en de nakomeling is genetisch identiek aan de ouder. Bij geslachtelijke voortplanting ontstaat juist een nieuwe combinatie van genen van twee ouders.
Bacteriën of cellen die door klonering genetisch zijn gemodificeerd, vallen in Nederland onder de regelgeving voor genetisch gemodificeerde organismen (ggo's), met voorschriften voor ingeperkt gebruik in laboratoria. Afhankelijk van het risico gelden eisen voor de inrichting van het laboratorium en een melding of vergunning. Raadpleeg de biologische veiligheidsfunctionaris van uw instelling. De indeling in veiligheidsniveaus staat in het artikel over BSL-klassen. Kweken en afval met ggo's worden gedeactiveerd, bijvoorbeeld in een autoclaaf.
DNA-klonering is een laboratoriumtechniek waarmee identieke kopieën van een specifiek stuk DNA of gen worden gemaakt. Het DNA wordt met restrictie-enzymen geknipt, met ligase in een vector (meestal een plasmide) geplakt en in een gastheer als E. coli gebracht, waar het zich bij elke celdeling vermenigvuldigt.
Het insert en de vector worden geknipt, aan elkaar geligeerd en in bacteriën gebracht (transformatie). De bacteriën worden op een voedingsbodem met antibioticum uitgeplaat, waarna alleen cellen met het plasmide groeien. De kolonies worden gecontroleerd op de aanwezigheid van het insert.
Beide technieken maken kopieën van DNA. PCR doet dat in een buisje met een DNA-polymerase en primers, zonder levende cellen. PCR is daarbij ook een onderdeel van het kloneringswerk: u gebruikt het om een insert te maken en om kolonies te controleren. Klonering zelf is een combinatie van technieken: knippen, plakken, transformeren, selecteren en controleren. Bij klonering wordt het DNA in een vector gebouwd en in cellen vermenigvuldigd. PCR is sneller; klonering levert zuivere kopieën van één fragment en maakt het mogelijk dat een fragment bewaard en in cellen tot expressie gebracht wordt.
DNA is een chemisch vrij stabiel molecuul, maar wordt afgebroken door nucleasen, hitte, vocht en UV-licht. Opgezuiverd DNA wordt in het laboratorium meestal ingevroren bewaard. In koude, droge omstandigheden kan DNA zeer lang aantoonbaar blijven: in uitzonderlijke gevallen is DNA van meer dan een miljoen jaar oud aangetoond.
Nee. RNA is meestal enkelstrengs, bevat ribose in plaats van deoxyribose en uracil in plaats van thymine. DNA slaat de erfelijke informatie op; RNA draagt die informatie over naar de eiwitproductie en heeft daarnaast regulerende en structurele functies.
Voor klonering zijn onder meer pipetten en pipetpunten, centrifugebuizen, een centrifuge, een incubator voor 37 °C, een elektroforese-opstelling en een thermocycler nodig. Het correct pipetteren van kleine volumes is bij klonering van groot belang, evenals het koud bewaren van enzymen en buffers.
Voor uw kloneringswerk levert Labvakhandel onder meer reagentia en kits voor moleculaire biologie, kweekmedia en voedingsbodems, petrischalen en ovens en incubatoren. Neem contact op voor advies over de juiste materialen voor uw toepassing.
Onderdeel van: Klinisch laboratorium
Disclaimer: De informatie in dit artikel is bedoeld als algemene technische toelichting. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl aanvaardt geen aansprakelijkheid voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische, klinische of industriële situaties. Raadpleeg voor uw eigen toepassing altijd de geldende normen, vakliteratuur en de documentatie van fabrikant en apparatuur. Voor het werken met genetisch gemodificeerde organismen en voor onderzoek met menselijk materiaal gelden wettelijke voorschriften; raadpleeg de geldende wet- en regelgeving en de bevoegde autoriteiten.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
