ATAC-seq (Assay for Transposase-Accessible Chromatin with sequencing) is een epigenomische techniek waarmee de open, toegankelijke regio's van het chromatine genoombreed in kaart worden gebracht. De methode is gebaseerd op het principe dat actieve promotors, enhancers en andere regulatoire elementen vrij zijn van nucleosomen en daardoor toegankelijk zijn voor het transposase-enzym Tn5. Door dit enzym in te zetten als moleculaire sonde en de ingevoegde sequencing-adapters te lezen via next-generation sequencing (NGS), produceert ATAC-seq een genoomwijde kaart van chromatinetoegankelijkheid in één protocol met minimale startmaterialeisen. ATAC-seq is daarmee een van de krachtigste en meest toegepaste methoden in de moderne epigenomica en functionele genomica.
ATAC staat voor Assay for Transposase-Accessible Chromatin. De techniek is in 2013 ontwikkeld door Jason Buenrostro en collega's in het laboratorium van William Greenleaf en Howard Chang aan Stanford University en maakt gebruik van een gemodificeerd Tn5-transposase-enzym. Transposon-gebaseerde insertie in chromatine is al langer bekend, maar ATAC-seq is de eerste methode die dit principe systematisch inzet voor genoomwijde chromatinetoegankelijkheidsmapping met slechts 500 tot 50.000 cellen als startmateriaal — een revolutionaire vermindering ten opzichte van toenmalige alternatieven als DNase-seq, dat tientallen miljoenen cellen vereiste.
Chromatine is het complex van DNA en bijbehorende eiwitten — voornamelijk histonen — in de celkern. In de celkern is het genoom niet uniform toegankelijk: regulatoire regio's zoals actieve promotors, enhancers en open insulatoren zijn vrij van nucleosomen (nucleosoom-deplete regio's, NDRs) en kunnen worden herkend door transcriptiefactoren en de transcriptiemachinerie. Gesloten chromatine, bedekt door nucleosomen, is gecompacteerd en transcriptioneel inactief. ATAC-seq maakt dit onderscheid direct zichtbaar: het Tn5-enzym kan uitsluitend DNA invoegen in open, nucleosoomvrije regio's; gesloten chromatine is fysiek ontoegankelijk. Na sequencing vertegenwoordigen de verrijkte pieken in het genoom de open chromatineregio's van de geanalyseerde cel. Zie ook het artikel over chromatine-immunoprecipitatie (ChIP) voor een complementaire techniek die niet de toegankelijkheid maar de eiwitbinding aan specifieke genomische locaties bepaalt.
Het ATAC-seq-protocol is opvallend compact vergeleken met alternatieve chromatinetoegankelijkheidstechnieken. Hieronder zijn de vijf kernstappen toegelicht zoals die in het standaardprotocol worden uitgevoerd.
Het startmateriaal voor ATAC-seq zijn verse, intact gelyseerde cellen of geïsoleerde celkernen. Celkwaliteit is kritisch: celdood leidt tot chromatineafbraak en hoog achtergrondniveau. Voor weefsels of bevroren materiaal zijn geoptimaliseerde protocollen beschikbaar, maar de kwaliteitsdrempel ligt hoger dan bij verse celkweek. De cellen worden gelyseerd in een milde, hypotonische lysisbuffer die de celmembraan permeabiliseert maar de kernmembraan en de chromatinestructuur intact laat — typisch een buffer met NP-40 of digitonine op ijs. Het aantal cellen per reactie in het standaardprotocol is 50.000, hoewel geoptimaliseerde versies werken met slechts 500 tot 10.000 cellen. Na lyse worden de kernen gecentrifugeerd en geresuspendeerd in de tagmentatiebuffer. Zie voor celkweekprincipes als voorbereiding het artikel over celkweektechnieken in het laboratorium. Celpopulaties kunnen voorafgaand worden geselecteerd via celsortering via FACS, wat bijzonder relevant is voor single-cell ATAC-seq en voor zuivere populaties uit heterogeen weefsel.
Tagmentatie is de kerninnovatie van ATAC-seq. Tagmentatie is de gelijktijdige fragmentatie van DNA én ligatie van sequencing-adapters door het Tn5-transposase in één reactiestap — de term is een samentrekking van "tagging" en "fragmentation". Het gemodificeerde Tn5-transposase-enzym is vooraf geladen met twee typen sequencing-adapters (Read 1 en Read 2 Illumina-adapters) en wordt direct aan de geïsoleerde kernen toegevoegd. Het Tn5-enzym werkt als een dimeer: het knipt twee parallelle DNA-strengen tegelijkertijd door en voegt de adapters tegelijkertijd in via een zogenoemde cut-and-paste-transposase-reactie. Tn5 kan uitsluitend DNA invoegen in regio's die fysiek toegankelijk zijn — nucleosoomvrije regio's en regio's met actief geremodelleerd chromatine. In gesloten chromatineregio's is de toegang voor Tn5 geblokkeerd door de aanwezigheid van nucleosomen. De tagmentatiereactie verloopt typisch 30 minuten bij 37 °C. Na tagmentatie wordt de reactie gestopt en het DNA gezuiverd via een zuiveringscolumn.
Het resultaat van tagmentatie is een mengsel van DNA-fragmenten van sterk variërende lengte: zeer korte fragmenten (<150 bp) zijn afkomstig uit nucleosoomvrije regio's (sub-nucleosomale fragmenten); fragmenten van 180–200 bp (mononucleosomale fragmenten) en hun veelvouden (dinucleosomaal, trinucleosomaal) zijn afkomstig uit regio's met een of meer nucleosomen. Dit nucleosomaal ladderpatroon — zichtbaar na kwaliteitscontrole via gelelektroforese of een capillaire-elektroforese-instrument — is een indicatie voor een geslaagde tagmentatie en voldoende chromatine-integriteit.
De getagmenteerde DNA-fragmenten bevatten al de Illumina-adapters, waardoor de bibliotheekpreparatie eenvoudiger is dan bij andere NGS-methoden. De fragmenten worden geamplificeerd via PCR met indexprimers die unieke barcodes toevoegen om monsters van elkaar te onderscheiden (multiplexing). Het aantal PCR-cycli is kritisch: te veel cycli leiden tot PCR-duplicaten en amplificatiebias; te weinig cycli geven onvoldoende bibliotheekopbrengst. In het oorspronkelijke protocol wordt aanbevolen om de PCR via een intermediaire qPCR-meting te stoppen op het punt van lineaire amplificatie (vóór het plateau van de sigmoïdale amplificatiecurve) — zie ook het artikel over qPCR / real-time PCR. Typisch zijn vijf tot twaalf PCR-cycli voldoende.
De ATAC-seq-bibliotheek wordt gesequenced op een NGS-platform. Voor standaard ATAC-seq wordt paired-end sequencing aanbevolen, waarbij beide uiteinden van elk DNA-fragment worden gelezen. Paired-end sequencing maakt het mogelijk de fragmentlengte te bepalen — essentieel voor de scheiding van sub-nucleosomale en mono- en dinucleosomale fragmenten bij downstream-analyse. De sequencingdiepte voor bulk ATAC-seq ligt typisch op 50 tot 200 miljoen reads per monster voor humane cellen. Op Illumina-platforms worden reads van 2 × 50 bp tot 2 × 150 bp gebruikt. Na sequencing worden de ruwe FASTQ-bestanden verwerkt via een bioinformatische pijplijn.
De bioinformatische verwerking van ATAC-seq-data verloopt in vaste stappen. Na kwaliteitsfiltering en adaptertrimming (Trimmomatic of fastp) worden de reads gealigneerd op het referentiegenoom met Bowtie2, waarna reads op mitochondriaal DNA worden gefilterd (mitochondriaal genoom is altijd nucleosoomvrij en geeft anders een overmatig hoog achtergrondsignaal). Vervolgens worden PCR-duplicaten verwijderd (Picard of sambamba). De sub-nucleosomale reads (<150 bp) worden gebruikt voor piekidentificatie via MACS2 of HMMRATAC: de resulterende pieken representeren open chromatineregio's. Mononucleosomale reads worden gescheiden voor nucleosoompositioneringsanalyse. De open chromatineregio's worden geannoteerd op basis van genomische kenmerken (promotors, enhancers, introns, intergenische regio's) via tools als ChIPseeker of HOMER. Motifanalyse — het zoeken naar transcriptiefactorbindingsmotieven in de pieken — onthult welke regulatoire eiwitten actief zijn in de bestudeerde cellen.
ATAC-seq meet de chromatinetoegankelijkheid: de fysieke toegankelijkheid van het genomisch DNA voor enzymatische inwerking. Dit is een directe maat voor de nucleosoomoccupantie op elke genomische positie. Regio's met hoge ATAC-seq-verrijking zijn nucleosoomvrij of nucleosoomarm; regio's met lage verrijking zijn gesloten en bedekt door nucleosomen. Chromatinetoegankelijkheid correleert sterk met transcriptionele activiteit: actieve promotors en enhancers zijn open; silenced genen en heterochromatine zijn gesloten. Toch is de relatie niet absoluut: ATAC-seq maakt geen onderscheid tussen een open regio die door een specifieke transcriptiefactor bezet wordt en een lege open regio. Voor de identificatie van specifieke transcriptiefactorbinding is ChIP-seq of zijn moderne variant CUT&RUN de aanvullende methode van keuze.
ATAC-seq biedt inzicht in meerdere niveaus van chromatineorganisatie tegelijk:
ATAC-seq en ChIP-seq zijn complementaire epigenomische technieken die verschillende aspecten van chromatinestructuur en genregulatie meten.
In de praktijk worden ATAC-seq en ChIP-seq als complementair paar ingezet: ATAC-seq brengt snel de open chromatineregio's in kaart; ChIP-seq bepaalt vervolgens welk specifiek eiwit of welke histonmodificatie aanwezig is op die open regio's.
CUT&RUN (Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease) en ATAC-seq worden beide ingezet voor epigenomisch onderzoek met lage celgetalvereisten, maar meten fundamenteel verschillende zaken.
De praktische keuze: wil je weten welke regio's open zijn in een celtype? → ATAC-seq. Wil je weten waar een specifiek eiwit of histonmodificatie zit? → CUT&RUN. In de praktijk worden beide complementair ingezet: ATAC-seq identificeert open regio's; CUT&RUN bepaalt welk eiwit die regio bezet. Dit is dezelfde logica als bij de combinatie ATAC-seq + ChIP-seq, maar CUT&RUN is uitvoerbaar met veel minder startmateriaal.
RNA-seq en ATAC-seq meten fundamenteel verschillende moleculaire fenomenen. RNA-seq meet de genexpressie op mRNA-niveau: het transcriptoom van de cel op het moment van analyse. ATAC-seq meet de chromatinetoegankelijkheid op DNA-niveau: de epigenomische staat van het genoom. De twee technieken zijn sterk complementair:
Multi-omics-integratie van ATAC-seq met RNA-seq is een gangbare combinatie in het moderne epigenomisch onderzoek: de open chromatineregio's worden gekoppeld aan de expressieniveaus van nabijgelegen genen om causale regulatoire verbanden te identificeren. Zie voor RNA-analyse het artikel over RNA-isolatie en RNA-analyse.
Bulk ATAC-seq en single-cell ATAC-seq (scATAC-seq) meten beide chromatinetoegankelijkheid via hetzelfde Tn5-tagmentatieprincipe, maar verschillen fundamenteel in wat ze als uitkomst geven. Bij bulk ATAC-seq worden tienduizenden cellen tegelijkertijd verwerkt; het resulterende signaal is een gemiddelde van alle cellen in het monster. Zeldzame celpopulaties of subtiele subpopulatieverschillen gaan daarin verloren. Bij scATAC-seq wordt elke cel individueel van een unieke moleculaire barcode voorzien, zodat de chromatineprofielen van duizenden afzonderlijke cellen apart worden geanalyseerd. Dit maakt het mogelijk om celtypes en celstaten te onderscheiden zonder vooraf geselecteerd te hebben op celtype. Het praktische verschil in toepasbaarheid: bulk ATAC-seq is robuuster, goedkoper en beter reproduceerbaar; scATAC-seq vereist gespecialiseerde platforms (zoals 10x Genomics Chromium), grotere sequencingdiepte en complexere bioinformatica, maar levert informatie over cellulaire heterogeniteit die in bulk onzichtbaar blijft.
ATAC-seq is de meest toegepaste methode voor chromatinetoegankelijkheidsmapping, maar heeft twee historische voorgangers.
DNase-seq (DNase I hypersensitive site sequencing) was vóór de introductie van ATAC-seq de goudstandaard voor chromatinetoegankelijkheidsmapping. De methode maakt gebruik van DNase I, een endonuclease dat DNA knipt in nucleosoomvrije regio's (DNase I hypersensitieve sites, DHS). DNase-seq heeft een hoge gevoeligheid en grote historische referentiedatasets (ENCODE), maar vereist tientallen miljoenen vers geïsoleerde cellen, een nauwkeurige optimalisatie van de DNase I-concentratie per celtype, en een bewerkelijker protocol dan ATAC-seq. ATAC-seq is in de meeste toepassingen de aanbevolen opvolger vanwege het lagere celgetal, de kortere protocolduur en de vergelijkbare informatie-inhoud.
FAIRE-seq (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements sequencing) isoleert nucleosoomvrij DNA via formaldehyde-cross-linking gevolgd door fenol-chloroform-extractie. Nucleosoomgebonden DNA precipiteert in de organische fase; nucleosoomvrij regulatoir DNA blijft in de waterige fase en wordt gesequenced. FAIRE-seq vereist geen enzym maar heeft een lagere signaal-ruis-verhouding dan ATAC-seq en DNase-seq en wordt tegenwoordig zelden nog toegepast.
Single-cell ATAC-seq (scATAC-seq) is een uitbreiding van bulk ATAC-seq waarbij de chromatinetoegankelijkheid van elke individuele cel afzonderlijk wordt bepaald. scATAC-seq is van bijzonder belang omdat het de epigenomische heterogeniteit binnen een celpopulatie zichtbaar maakt die in bulk-experimenten verborgen blijft: zeldzame celpopulaties, differentiatiestadia en celtype-specifieke regulatoire programma's kunnen worden geïdentificeerd.
De meest gebruikte platforms voor scATAC-seq zijn:
De bioinformatische analyse van scATAC-seq omvat dimensiereductie (LSI, UMAP), clusteranalyse, celtype-annotatie op basis van open chromatineregio's bij celtype-specifieke loci, en traject-analyse voor het reconstrueren van differentiatiepaden. Vrij beschikbare analysepakketten zijn ArchR, Signac (als onderdeel van Seurat) en SnapATAC2. Zie voor de achtergrond van celsortering als voorbereidende stap het artikel over celsortering via FACS.
Ja. ATAC-seq is inherent een high-throughput-methode: de combinatie met next-generation sequencing maakt het mogelijk de chromatinetoegankelijkheid van alle ~3,2 miljard basenparen van het humane genoom in één meting te bepalen. Meerdere monsters kunnen worden gemultiplexed door unieke indexadapters te gebruiken tijdens de PCR-stap, waarna alle monsters samen op één sequencingrun worden geladen en na demultiplexing per monster worden geanalyseerd. In combinatie met single-cell platforms kunnen tienduizenden cellen per experiment worden geprofileerd. Deze hoge doorvoer maakt ATAC-seq geschikt voor grootschalige screeningstudies, celatlassen en vergelijkende epigenomische analyses.
De sequencingdiepte voor bulk ATAC-seq bedraagt typisch 50 tot 200 miljoen paired-end reads voor humane cellen, afhankelijk van het genoomformaat en de gewenste resolutie. Vuistregels:
Voor de interpretatie van sequencingdiepte en kwaliteitsscores, zie het artikel over next-generation sequencing (NGS).
Sequencingdiepte (ook: read depth of coverage) is het gemiddeld aantal keren dat een specifieke basenpositie in het genoom wordt gelezen. De formule is: coverage = (aantal reads × readlengte) ÷ genoomgrootte. Een 30×-coverage bij whole-genome sequencing betekent dat elke positie gemiddeld 30 maal is gelezen — voldoende om heterozygote varianten betrouwbaar te detecteren.
Voor ATAC-seq is het concept anders toegepast dan bij WGS. ATAC-seq is een verrijkingstechniek: slechts 1–5% van het humane genoom is open chromatine. Een 30×-coverage over het hele genoom is voor ATAC-seq geen zinvolle maatstaf — wat telt is de verrijking in de open regio's ten opzichte van de achtergrond. Daarom wordt de diepte bij ATAC-seq uitgedrukt in totaal aantal reads per monster na kwaliteitsfiltering en verwijdering van mitochondriale reads en PCR-duplicaten.
Wat is voldoende diepte?
Te weinig diepte leidt tot gemiste pieken, een lage TSS-score en onbetrouwbare differentiële toegankelijkheidsanalyse. Te veel diepte levert verminderende meeropbrengst op en verhoogt de kans op sequencing-artefacten. Zie het artikel over next-generation sequencing (NGS) voor de achtergrond van sequencingkwaliteit en coverageberekening.
De pieken in een ATAC-seq-profiel vertegenwoordigen genomische regio's met verhoogde chromatinetoegankelijkheid. De interpretatie is gelaagd:
Pieken bij gekende promotors (TSS, transcriptiestartplaats) correleren met actieve genen. Pieken in intergenische regio's of intronen zijn potentiële enhancers of insulatoren. Een enhancer is een regulatoire DNA-sequentie die de transcriptie van een doelgen kan activeren, ook wanneer deze op grote afstand van dat gen ligt; in ATAC-seq zijn enhancers herkenbaar als open chromatineregio's in intergenische regio's die transcriptiefactorbindingsmotieven bevatten. Een hoge verrijking bij de TSS — de zogenoemde TSS-verrijkingsscore (TSS enrichment score) — is de primaire kwaliteitsmetriek voor ATAC-seq: een score boven 7 tot 10 geldt als goed; lage TSS-verrijking wijst op slechte chromatineintegriteit of protocolproblemen.
Smalle, scherpe pieken typeren transcriptiefactorbindingsplaatsen of nucleosoomvrije regio's bij actieve promotors. Brede pieken worden geassocieerd met superenhancers of uitgebreide open chromatinedomeinen in differentiatie-gerelateerde loci.
Bij een kwalitatief goede ATAC-seq-bibliotheek is in het fragmentgrootteverdelingsplot (insert size distribution) een nucleosoomladder zichtbaar: een duidelijke piek bij <150 bp (sub-nucleosomaal), gevolgd door pieken bij ~200 bp (mononucleosomaal), ~400 bp (dinucleosomaal) en ~600 bp (trinucleosomaal). Dit patroon bevestigt dat het Tn5-enzym de nucleosomale structuur van het chromatine als ruimtelijke sonde heeft gebruikt.
De DNA-sequenties van ATAC-seq-pieken worden doorzocht op bekende transcriptiefactorbindingsmotieven via tools als HOMER, MEME-ChIP of JASPAR. De meest verrijkte motieven geven aan welke transcriptiefactoren actief zijn in de bestudeerde cel. Dit is bijzonder waardevol voor het identificeren van celtype-bepalende transcriptiefactoren (master regulators).
Door ATAC-seq-profielen van twee condities (behandeld versus onbehandeld, celtype A versus celtype B) te vergelijken, worden regio's geïdentificeerd die significant meer of minder open zijn. Differentieel toegankelijke regio's geven directe aanwijzingen voor regulatoire veranderingen die ten grondslag liggen aan het verschil in celstaat of genexpressie.
ATAC-seq is de techniek van voorkeur wanneer een van de volgende vragen centraal staat:
ATAC-seq is minder geschikt wanneer de vraag gericht is op de binding van een specifiek eiwit of de aanwezigheid van een specifieke histonmodificatie op een locus — daarvoor is ChIP-seq of CUT&RUN de aangewezen methode. ATAC-seq is evenmin informatief voor de bepaling van DNA-methyleringspatronen, waarvoor bisulfiet-sequencing de standaardmethode is.
scATAC-seq heeft bijgedragen aan de opbouw van grote celatlassen waarin tienduizenden individuele cellen worden gekarakteriseerd op basis van hun open chromatineprofiel. Het humane celatlasproject (Human Cell Atlas) integreert scRNA-seq en scATAC-seq om celtypen te definiëren op basis van zowel genexpressie als epigenomische staat. In immunologie worden ATAC-seq-profielen ingezet om T-cel-subpopulaties en hun activatiestaten te onderscheiden op basis van toegankelijkheid bij cytokinepromotors en enhancers.
Veranderingen in chromatinetoegankelijkheid zijn een kenmerk van kankercellen. Aberrante activering van enhancers, sluiting van tumorsuppressorpromotors en activering van oncogene regulatoire programma's worden gedetecteerd via ATAC-seq. In hematologische tumoren zoals acute myeloïde leukemie (AML) onthult scATAC-seq de intratumorale heterogeniteit en identificeert leukemische stamcelsubklonen op basis van hun specifieke chromatinetoegankelijkheidsprofiel. ATAC-seq wordt ook ingezet voor de identificatie van regulatoire regio's die verantwoordelijk zijn voor therapieresistentie.
De progressieve opening en sluiting van chromatineregio's tijdens de embryonale ontwikkeling en celdifferentiatie kan nauwkeurig worden gevolgd met ATAC-seq. Bij de herprogrammering van somatische cellen naar geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) onthult ATAC-seq het sequentiële herstel van het pluripotente chromatineprogramma. Vergelijkende ATAC-seq van pluripotente stamcellen en gedifferentieerde celtypen toont welke enhancers worden geactiveerd bij celtypebepaling.
Epigenetische geneesmiddelen — HDAC-remmers, BET-remmers, DNMT-remmers — veranderen de globale chromatinestructuur. ATAC-seq is een directe readout voor de werkzaamheid van dergelijke geneesmiddelen: openen of sluiten van specifieke chromatineregio's na behandeling bevestigt het epigenetisch mechanisme. In de klinische ontwikkeling van epigenetische therapieën wordt ATAC-seq steeds vaker toegepast als biomarker voor therapierespons.
Veel ziekte-geassocieerde genetische varianten (SNPs) geïdentificeerd via GWAS-studies bevinden zich niet in coderende regio's maar in regulatoire regio's. Door GWAS-SNPs te vergelijken met ATAC-seq-pieklocaties in het relevante celtype (bijvoorbeeld islet-cellen bij diabetes, neuronale cellen bij neurologische aandoeningen) kan worden bepaald welke SNPs functioneel relevant zijn omdat zij open chromatineregio's overlappen. Zie het artikel over SNP-genotypering en PCR-technieken voor de achtergrond van genetische variantanalyse.
ATAC-seq wordt in de moderne epigenomica zelden als geïsoleerde techniek ingezet maar maakt deel uit van multimodale analytische strategieën. Gangbare combinaties zijn:
Een ATAC-seq-protocol vereist een beperkte set apparatuur en verbruiksartikelen vergeleken met ChIP-seq, juist vanwege het compacte protocol zonder cross-linking en immunoprecipitatiestappen.
Essentiële apparatuur omvat een koelcentrifuge voor kernextractie en wasprocedures, een verwarmingsblok of waterbad voor de tagmentatiereactie op 37 °C, een real-time thermocycler voor de PCR-amplificatiestap met tussentijdse qPCR-monitoring, en een instrument voor bibliotheekkwaliteitscontrole — een capillaire-elektroforese-instrument (Bioanalyzer-type of TapeStation) voor bepaling van de fragmentgrootteverdeling en het nucleosoomladderpatroon. Zie ook het artikel over laboratoriumcentrifuges voor achtergrond over centrifugatie.
Verbruiksartikelen zijn: centrifugebuizen en reactievaatjes (laag-adsorptie, nucleasevrij), pipetpunten (nucleasevrij, gefilterd voor RNase-vrij werken), Tn5-transposase-kits (commercieel verkrijgbaar van Illumina als Nextera DNA Library Preparation Kit, of als OMNI-ATAC-geoptimaliseerde kits van verschillende leveranciers), DNA-zuiveringscolumns voor post-tagmentatieopwerking, en PCR-reagentia met indexadapters voor demultiplexing. Bekijk ons assortiment voor biotechnologie en moleculaire biologie.
ATAC staat voor Assay for Transposase-Accessible Chromatin. De "seq" in ATAC-seq verwijst naar de koppeling met next-generation sequencing voor de genoomwijde uitlezing van de tagmentatieregio's.
Sequencingsmethoden worden ingedeeld in drie generaties op basis van het werkingsprincipe en het toepassingsformaat:
ATAC-seq is een tweede-generatie NGS-toepassing: de Tn5-tagmentatiestap genereert korte fragmenten (sub-nucleosomaal tot dinucleosomaal, <600 bp) die op Illumina-platforms worden gesequenced. Long-read ATAC-seq-varianten zijn in ontwikkeling maar bevinden zich nog in de onderzoeksfase; het voordeel zou zijn dat nucleosoompositionering over langere genomische afstanden in één read zichtbaar wordt.
De kosten van ATAC-seq zijn relatief laag vergeleken met andere epigenomische methoden, met name doordat geen antilichamen nodig zijn en het protocol compact is. De grootste kostenpost is de NGS-sequencing zelf: voor bulk ATAC-seq op humane cellen zijn 50 tot 200 miljoen paired-end reads nodig, wat op gangbare Illumina-platforms neerkomt op circa 100 tot 400 euro per monster (afhankelijk van het platform, de run-configuratie en de leverancier). De commerciële Tn5-tagmentatie-kits (zoals de Nextera-gebaseerde of OMNI-ATAC-kits) kosten per reactie doorgaans 20 tot 60 euro. Ter vergelijking: ChIP-seq vereist een gevalideerd antilichaam (100 tot 500 euro per antilichaam), een bewerkelijker protocol van meerdere dagen en doorgaans meer startcellen, wat de totale kosten per monster significant verhoogt. scATAC-seq is aanmerkelijk duurder dan bulk ATAC-seq vanwege de kosten van het druppelencapsulatie-platform en de hogere sequencingdiepte die vereist is. Voor laboratoria die ATAC-seq voor het eerst uitvoeren zijn de initiële optimalisatiekosten — voor het bepalen van de juiste celconcentratie, lysiscondities en PCR-cyclusaantal — de belangrijkste variabele factor.
Een piek in een ATAC-seq-profiel is een genomische regio waar significant meer Tn5-inserties zijn aangetroffen dan in de directe omgeving. Dit is de bioinformatische vertaling van een open, nucleosoomvrije chromatineregio: omdat Tn5 alleen DNA kan invoegen waar chromatine fysiek toegankelijk is, vertegenwoordigt elke piek een regio die in de geanalyseerde cellen actief is opengesteld. Pieken worden geïdentificeerd door tools als MACS2, die een statistisch model gebruiken om te bepalen waar de lokale insertiedensiteit significant boven het achtergrondniveau uitkomt. De positie van een piek bepaalt zijn biologische interpretatie: een piek bij een bekende promotor (TSS) duidt op een actief gen; een piek in een intergenische regio is een kandidaat-enhancer of insulator; een piek bij een CTCF-bindingsplaats duidt op een chromatinedomeingrens. De hoogte van een piek (het aantal reads) weerspiegelt de frequentie waarmee die regio open is in de celpopulatie — bij bulk ATAC-seq is dit een gemiddelde over alle cellen in het monster.
ChIP-seq heeft een aantal praktische en technische nadelen ten opzichte van ATAC-seq. Ten eerste vereist ChIP-seq een gevalideerd, hoogkwalitatief antilichaam specifiek voor het eiwit of de histonmodificatie van interesse — de beschikbaarheid, specificiteit en batch-tot-batch-consistentie van antilichamen zijn terugkerende bronnen van variabiliteit en mislukking. Ten tweede vereist het standaardprotocol tien- tot honderdmaal meer cellen (106–107) dan ATAC-seq (500–50.000), wat het gebruik bij schaars materiaal zoals primaire patiëntsamples bemoeilijkt. Ten derde duurt het ChIP-seq-protocol twee tot drie dagen inclusief cross-linking, sonicatie, immunoprecipitatie en reversal van cross-links, tegenover drie tot vier uur voor ATAC-seq. Ten vierde geeft één ChIP-seq-experiment informatie over slechts één eiwit of modificatie tegelijk; voor een compleet beeld van de epigenomische staat zijn meerdere ChIP-seq-experimenten nodig. ATAC-seq geeft in één experiment een globaal overzicht van alle open chromatineregio's, ongeacht welk eiwit erop gebonden is. Het voornaamste voordeel van ChIP-seq — de mogelijkheid om te bepalen welk specifiek eiwit of welke histonmodificatie aanwezig is op een locus — kan ATAC-seq niet bieden.
Een transposase is een enzym dat DNA-segmenten (transposons) uit het genoom kan uitknippen en elders opnieuw invoegen — een zogeheten cut-and-paste-mechanisme. In ATAC-seq wordt een gemodificeerde versie van het bacteriële Tn5-transposase gebruikt omdat dit enzym uitzonderlijk efficiënt DNA invoegt in toegankelijk chromatine, compact genoeg is om nucleosoomvrije regio's te penetreren, en commercieel beschikbaar is als hyperactief mutant met hoge insertie-activiteit. Het cruciale voordeel van Tn5 ten opzichte van DNase I is dat Tn5 de sequencing-adapters gelijktijdig met de knipping invoegt (tagmentatie), waardoor separate adaptor-ligatiestappen overbodig worden en het protocol teruggebracht wordt tot enkele uren.
Chromatine is het complex van genomisch DNA gewikkeld rond histoneiwitten in de celkern. De basiseenheid van chromatine is het nucleosoom: 147 basenparen DNA gewikkeld rond een octameer van vier histonparen (H2A, H2B, H3 en H4). Of een genomische regio toegankelijk is — dat wil zeggen, vrij van nucleosomen — bepaalt direct of transcriptiefactoren en RNA-polymerase er aan kunnen binden en een gen actief kan worden afgelezen. Chromatinetoegankelijkheid is daarmee een directe maat voor de transcriptionele activiteit van regulatoire elementen: open chromatine wijst op actieve of potentieel actieve genen en regulatoire regio's, gesloten chromatine op transcriptioneel inactieve of gesuppresseerde regio's.
Tagmentatie is de gelijktijdige fragmentatie van DNA en het invoegen van sequencing-adapters door het Tn5-transposase in één enzymreactie. De term is afgeleid van "tagging" (labelen met adapters) en "fragmentation" (DNA-fragmentatie). In klassieke NGS-workflows zijn DNA-fragmentatie en adapterligatie twee aparte stappen; tagmentatie combineert deze tot één stap van 30 minuten. Dit is de reden dat het ATAC-seq-protocol zo compact is: waar ChIP-seq doorgaans twee tot drie dagen vergt, kan een ATAC-seq-bibliotheek binnen drie tot vier uur klaar zijn voor sequencing.
ATAC-footprinting is een analysemethode waarbij de precieze positie van gebonden transcriptiefactoren wordt afgeleid uit het ATAC-seq-signaal. Wanneer een transcriptiefactor gebonden is aan zijn DNA-motief, blokkeert het de Tn5-insertie op die specifieke positie. Dit resulteert in een lokale depletie van Tn5-inserties — de "voetafdruk" — omgeven door verhoogde insertiedensiteit in de flanken van het bindingsmotief. Door het insertiepatroon genoombreed op te meten en te vergelijken met bekende transcriptiefactormotieven uit databases als JASPAR of HOCOMOCO, kan worden bepaald welke transcriptiefactoren op welke genomische locaties actief gebonden zijn. Footprinting vereist een hoge sequencingdiepte (typisch >200 miljoen reads) en specifieke bioinformatische tools zoals HINT-ATAC of Tobias.
De TSS-verrijkingsscore (Transcription Start Site enrichment score) is de primaire kwaliteitsmetriek voor ATAC-seq. De score wordt berekend als de verhouding tussen de Tn5-insertiedensiteit direct bij transcriptiestartplaatsen van bekende actieve genen en de achtergrond-insertiedensiteit in flanken op afstand van die TSS. Actieve promotors zijn altijd nucleosoomvrij; een goede ATAC-seq-experiment laat bij TSS-posities dus een duidelijke verrijkingspiek zien. Als vuistregel geldt: TSS-verrijkingsscore ≥ 7 is aanvaardbaar, ≥ 10 is goed. Een score onder 5 wijst op slechte chromatinekwaliteit — veroorzaakt door celdood, overmatige lyse of suboptimale tagmentatie — en het experiment moet worden herhaald.
ATAC-seq-pieken variëren in breedte afhankelijk van de aard van de open chromatineregio. Smalle pieken bij transcriptiefactorbindingsplaatsen zijn typisch 100 tot 300 bp breed; pieken bij actieve promotors zijn 200 tot 500 bp; brede pieken bij superenhancers of open chromatinedomeinen kunnen enkele kilobasen beslaan. De piekbreedte is afhankelijk van de bioinformatische tool en de gehanteerde parameters (MACS2-parameters voor minimale piekscore en breedte).
Standaard ATAC-seq is geoptimaliseerd voor verse cellen, waarbij de chromatine-integriteit optimaal is. Voor bevroren weefsel zijn geoptimaliseerde protocollen ontwikkeld — zoals het cryo-ATAC-seq-protocol en het OMNI-ATAC-protocol — die gebruik maken van detergenten als digitonine en NP-40 in combinatie om de kernextractie te verbeteren. De kwaliteit van bevroren-weefsel-ATAC-seq is lager dan van vers materiaal, maar voor veel routinetoepassingen acceptabel. Kwaliteitscontrole via TSS-verrijkingsscore en nucleosoomladderpatroon is bij bevroren materiaal des te belangrijker.
Ja. Single-cell ATAC-seq (scATAC-seq) is een van de snelst groeiende toepassingen in de epigenomica. Commerciële platforms zoals het 10x Genomics Chromium-systeem maken scATAC-seq routinematig uitvoerbaar voor duizenden tot tienduizenden cellen per run. scATAC-seq geeft inzicht in celtype-heterogeniteit op epigenomisch niveau en is complementair aan scRNA-seq.
MNase-seq (Micrococcal Nuclease sequencing) gebruikt het enzym MNase om het DNA te knippen in de linkerregio's tussen nucleosomen. Het beschermt DNA dat door nucleosomen is bedekt; het vrije, nucleosoomgebonden DNA wordt gesequenced om nucleosoomposities genoombreed in kaart te brengen. ATAC-seq knipt juist in de nucleosoomvrije, open regio's. De twee technieken zijn informatief complementair: MNase-seq voor nucleosoompositionering; ATAC-seq voor open regio-identificatie.
ATAC-seq sluit aan bij een brede reeks moleculaire en epigenomische technieken in de Labvakhandel-kennisbank. Voor de complementaire techniek die eiwit-DNA-binding bepaalt via immunoprecipitatie, zie het artikel over chromatine-immunoprecipitatie (ChIP). Voor de sequencing-uitlezing van ATAC-seq-bibliotheken, zie het artikel over next-generation sequencing (NGS). Voor de qPCR-bewaking van de PCR-amplificatiestap in ATAC-seq, zie het artikel over qPCR / real-time PCR. Voor celsortering als voorbereiding voor single-cell of populatiespecifieke ATAC-seq, zie het artikel over celsortering via FACS. Voor de kwaliteitscontrole van ATAC-seq-bibliotheken via gelelektroforese, zie het artikel over gelelektroforese. Voor celkweek als voorbereiding van ATAC-seq-experimenten, zie het artikel over celkweektechnieken in het laboratorium. Voor DNA-isolatie als vergelijkende nucleïnezuurtechniek, zie het artikel over DNA-isolatie en DNA-extractie. Voor RNA-analyse als complementaire expressietechniek, zie het artikel over RNA-isolatie en RNA-analyse. Voor CRISPR-Cas9-toepassingen waarbij ATAC-seq als validatiemethode voor chromatineveranderingen wordt ingezet, zie het artikel over CRISPR-Cas9 en genoombewerking. Voor genetische variantanalyse gekoppeld aan open chromatineregio's, zie het artikel over SNP-genotypering en PCR-technieken.
Neem contact op voor advies over de juiste apparatuur en verbruiksartikelen voor uw ATAC-seq-workflow. Bekijk ook ons assortiment voor biotechnologie en moleculaire biologie.
Disclaimer: De informatie in dit artikel is bedoeld als algemene technische toelichting. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl aanvaardt geen aansprakelijkheid voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische, klinische of industriële situaties. Raadpleeg voor uw eigen toepassing altijd de geldende normen, vakliteratuur en de documentatie van fabrikant en apparatuur.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
