Co-immunoprecipitatie (co-IP)

Co-immunoprecipitatie (co-IP) is een techniek waarmee wordt aangetoond dat twee of meer eiwitten in een cel of weefsel fysiek met elkaar interacteren. Een antilichaam tegen één bekend eiwit — het "bait" — wordt gebruikt om dat eiwit uit een celextract te isoleren. Als een ander eiwit, de "prey", op het moment van lysis in een complex met het bait zat, wordt het meegesleept in de precipitatie. De aanwezigheid van de prey in het precipitaat is het experimentele bewijs dat beide eiwitten in vivo met elkaar geassocieerd zijn. Co-IP is een van de meest gebruikte methoden in de cel- en moleculaire biologie om eiwit-eiwit-interacties, signaaltransductieroutes en eiwitcomplexen te onderzoeken.

Wat is co-immunoprecipitatie?

Co-IP is een variant van gewone immunoprecipitatie (IP). Bij standaard-IP wordt een antilichaam gebruikt om één specifiek eiwit te isoleren en te bevestigen — het doel is het eiwit zelf. Bij co-IP ligt de nadruk niet op het geprecipiteerde eiwit, maar op wat er nog meer in het precipitaat meekomt. Het antilichaam is gericht tegen het bait-eiwit; als het bait op het moment van lysis een complex vormde met een interactiepartner, blijft die binding intact tijdens de precipitatie en wordt de partner mee neergeslagen. Na elutie wordt het precipitaat geanalyseerd — meestal via western blot, soms via massaspectrometrie — om te bepalen welke eiwitten zijn meegekomen.

Het onderscheidende kenmerk van co-IP ten opzichte van IP is dus niet de uitvoering, die identiek is, maar het doel: IP isoleert en bevestigt een eiwit; co-IP gebruikt diezelfde isolatie om een interactie tussen twee eiwitten aan te tonen.

Wat is het verschil tussen IP en co-IP?

Bait en prey: kernbegrippen van co-IP

In een co-IP-experiment wordt het eiwit waartegen het antilichaam is gericht het bait (lokaas) genoemd. Het eiwit dat samen met het bait wordt meegeprecipiteerd — omdat het op het moment van lysis in een complex met het bait zat — heet de prey (prooi). De western blot na co-IP wordt doorgaans geïmmunodetecteerd op de prey: de aanwezigheid van een prey-band in het precipitaat van het bait is het bewijs dat beide eiwitten in vivo samen een complex vormen.

Voor een sluitend bewijs van interactie wordt vaak een reverse co-IP uitgevoerd: het experiment wordt herhaald met een antilichaam tegen de oorspronkelijke prey als nieuw bait, waarbij dan het oorspronkelijke bait als prey moet meekomen. Een interactie die in beide richtingen wordt bevestigd, sluit artefacten van aspecifieke binding grotendeels uit.

Stap-voor-stap co-IP-protocol

Een typisch co-IP-experiment verloopt in zes stappen, doorgaans uit te voeren op één werkdag met voorbereide cellysaten:

1. Cellysis — lyseer cellen in een niet-denaturerende buffer (NP-40 0,5 %, CHAPS 1 % of digitonin 1 %) met protease- en fosfatase-inhibitoren, op ijs gedurende 20 tot 30 minuten. RIPA-buffer is voor de meeste eiwit-eiwit-interacties te stringent en breekt zwakkere complexen af nog vóór de antilichaamincubatie.
2. Pre-clearing — incubeer het lysaat 30 tot 60 minuten met "lege" protein A/G-beads zonder antilichaam, om eiwitten weg te vangen die aspecifiek aan de beads zelf binden. Verwijder de beads via centrifugatie of magnetische separatie en gebruik het pre-gecleared lysaat voor de eigenlijke immunoprecipitatie.
3. Antilichaambinding — voeg 1 tot 5 µg primair antilichaam, gericht tegen het bait, toe aan 500 tot 1000 µg totaaleiwit. Incubeer 1 tot 4 uur, of overnight bij 4 °C, onder zachte rotatie.
4. Precipitatie — voeg protein A- of protein G-beads (magnetisch of agarose) toe en incubeer 1 uur bij 4 °C onder zachte rotatie. Protein G heeft een bredere bindingscapaciteit voor muis-IgG1, terwijl protein A sterker bindt aan konijn-IgG; de keuze hangt dus af van de antilichaamsubklasse en het dier van herkomst.
5. Wassen — was de beads drie- tot vijfmaal met wasbuffer, doorgaans dezelfde samenstelling als de lysisbuffer, eventueel met een iets hogere zoutconcentratie. Elke wasstap verwijdert aspecifiek gebonden eiwit; te stringent wassen verbreekt echter ook de echte bait-prey-interactie.
6. Elutie en analyse — elueer het gebonden complex door koken in 1× Laemmli-sample buffer (95 °C, 5 minuten), of via competitief elueren met een overmaat peptide voor mildere condities. Laad de input-, bound- en flow-through-fracties op SDS-PAGE en immunodetecteer via western blot met een antilichaam tegen de prey.

Voor kwantitatieve interactiestudies wordt de bound-fractie genormaliseerd op de hoeveelheid geprecipiteerd bait, geladen op een tweede blot, om verschillen in precipitatie-efficiëntie tussen condities te compenseren.

Input, bound en flow-through: de drie fracties op de western blot

Bij een IP- of co-IP-experiment worden standaard drie fracties op de western blot geladen, elk met een eigen functie in de interpretatie van het resultaat:

• Input — een kleine hoeveelheid (1 tot 5 %) van het totale celextract vóór de immunoprecipitatie. Dient als referentie: bewijst dat zowel bait als prey aanwezig zijn in het extract en geeft de verwachte bandgrootte van beide eiwitten.
• Bound (elutie/precipitaat) — de fractie die is meegeprecipiteerd door het antilichaam. Dit is het eigenlijke co-IP-resultaat: een prey-band in deze fractie toont aan dat het eiwit specifiek met het bait is meegekomen.
• Flow-through (supernatant) — de fractie die niet aan het antilichaam gebonden is. Als het bait hier nog sterk aanwezig is, was de precipitatie inefficiënt — door onvoldoende antilichaam of ongeschikte condities.

Welke buffer wordt gebruikt voor co-IP?

De keuze van lysisbuffer is bepalend voor het slagen van een co-IP-experiment, omdat de buffer enerzijds cellen voldoende moet lyseren en anderzijds de native eiwit-eiwit-interactie intact moet laten. Veelgebruikte buffers, van mild naar stringent:

• NP-40-buffer (0,5 %) — mild non-ionogeen detergens; behoudt de meeste eiwit-eiwit-interacties; standaardkeuze als startpunt voor co-IP.
• CHAPS-buffer (1 %) — zwitterionisch detergens; mild voor membraaneiwitcomplexen; geschikt wanneer NP-40 de interactie verstoort.
• Digitonin-buffer (1 %) — zeer mild; selectief voor plasmamembraanpermeabilisatie; behoudt organel- en membraanassociaties relatief goed.
• RIPA-buffer — bevat SDS (0,1 %) en natriumdeoxycholaat naast NP-40; stringenter en effectiever in het oplossen van moeilijk lyseerbare eiwitten, maar te denaturerend voor de meeste co-IP-toepassingen omdat zwakkere eiwitcomplexen erdoor uiteenvallen. RIPA-buffer wordt vooral toegepast bij gewone IP, waarbij alleen het doeleiwit zelf moet worden geïsoleerd en een interactie niet hoeft te worden behouden.

Alle lysisbuffers voor co-IP worden standaard aangevuld met protease-inhibitoren (PMSF, complete protease-inhibitor-cocktails) en, bij onderzoek naar fosforylering-afhankelijke interacties, fosfatase-inhibitoren.

Controles bij co-IP

De interpretatie van een co-IP-resultaat staat of valt met de juiste controles, omdat aspecifieke binding aan beads of antilichaam een fout-positief signaal kan veroorzaken:

• IgG-isotype-controle — een irrelevant antilichaam van dezelfde soort en subklasse als het primaire antilichaam, geïncubeerd met een parallel lysaat. Een prey-signaal in deze controle wijst op aspecifieke binding in plaats van een echte interactie.
• Beads-only-controle — beads zonder antilichaam, om te beoordelen of de prey rechtstreeks aan het beadmateriaal bindt.
• Reverse co-IP — herhaling van het experiment met de prey als nieuw bait, zoals hierboven beschreven, om de interactie onafhankelijk te bevestigen.
• Knockout- of knockdown-controle — co-IP in cellen waarin het bait of de prey is uitgeschakeld (bijvoorbeeld via CRISPR-Cas9), waarbij het verdwijnen van het prey-signaal de specificiteit van de interactie ondersteunt.

Bij detectie wordt bovendien aanbevolen secundaire antilichamen te gebruiken die specifiek de lichte keten van immunoglobulines herkennen, om te voorkomen dat de zware keten van het neergeslagen primaire antilichaam (circa 55 kDa) het signaal van een prey-eiwit met vergelijkbare molecuulmassa overstemt.

Cross-linking voor zwakke of transiënte interacties

Voor eiwitcomplexen met lage affiniteit of kortlevende interacties — zoals kinase-substraatcontacten, GTPase-effectorbindingen of transcriptiefactor-co-activatorcomplexen — wordt de interactie vaak verbroken tijdens lysis en wassen. Chemische cross-linking vóór lysis stabiliseert de interactie door covalente bindingen te leggen tussen bait en prey. Veelgebruikte reagentia zijn formaldehyde (1 % in PBS, ongeveer 10 minuten op intacte cellen, gevolgd door afblussen met glycine), DSP (dithiobis-succinimidylpropionaat, reversibel via reductie met DTT) en BS3 (bis-sulfosuccinimidylsuberaat, niet-reversibel maar membraan-impermeabel en daardoor geschikt voor selectieve oppervlaktecross-linking).

Na cross-linking, lysis en immunoprecipitatie wordt het complex tijdens elutie weer ontkoppeld: formaldehyde door verhitting, DSP door DTT-reductie in de sample buffer. Voor de identificatie van onbekende interactiepartners wordt cross-linking-IP doorgaans gecombineerd met massaspectrometrie (IP-MS of XL-MS) in plaats van western blot, omdat massaspectrometrie alle co-gepurificeerde eiwitten ongericht identificeert in plaats van slechts één vooraf gekozen prey.

Wat is het verschil tussen co-IP en ChIP?

Co-IP en chromatine-immunoprecipitatie (ChIP) delen hetzelfde basisprincipe — precipitatie van een doelmolecuul via een specifiek antilichaam — maar richten zich op een fundamenteel ander type interactie. Co-IP isoleert eiwitcomplexen om een eiwit-eiwit-interactie aan te tonen; het eindproduct is een eiwit dat via western blot of massaspectrometrie wordt geanalyseerd. ChIP isoleert eiwit-DNA-complexen om te bepalen waar een eiwit aan het genoom bindt; het eindproduct is DNA dat via qPCR of sequencing wordt geanalyseerd. Een verwante derde variant is RIP (RNA-immunoprecipitatie), waarbij het doelwit een eiwit-RNA-interactie is in plaats van een eiwit-eiwit- of eiwit-DNA-interactie.

Alternatieven wanneer co-IP geen signaal oplevert

Als co-IP ondanks zorgvuldige optimalisatie geen reproduceerbaar signaal oplevert, zijn er verschillende alternatieve methoden om een eiwit-eiwit-interactie aan te tonen:

• GST- of His-tag pull-down — gebruikt recombinant gezuiverd bait-eiwit met een affiniteitstag in plaats van een antilichaam; sluit endogene factoren uit en geeft een controleerbare bait-concentratie.
• BioID of TurboID — een biotine-ligase wordt aan het bait gefuseerd, waardoor nabijgelegen eiwitten in levende cellen worden gebiotinyleerd en vervolgens via streptavidine-pulldown kunnen worden geïsoleerd; vangt ook zwakke en transiënte interacties die co-IP zou missen.
• Yeast two-hybrid (Y2H) — een gistsysteem voor systematisch screenen van mogelijke interactiepartners van een bait-eiwit, geschikt voor het identificeren van nieuwe, nog onbekende interacties op grote schaal.
• Proximity ligation assay (PLA) — detecteert eiwit-eiwit-interacties in situ in gefixeerde cellen of weefsel met fluorescentiemicroscopie, en behoudt daarmee de ruimtelijke context van de interactie.

Co-IP en Y2H zijn complementaire methoden: Y2H is geschikt om kandidaat-interactiepartners te ontdekken, terwijl co-IP geschikt is om een vermoede interactie te bevestigen in de context van het endogene, native eiwitmilieu van de cel. Een interactie die in Y2H wordt gevonden, wordt daarom doorgaans pas als betrouwbaar beschouwd nadat deze ook via co-IP is bevestigd.

Toepassingen van co-IP

Co-IP wordt breed ingezet in onderzoek naar:

• Signaaltransductieroutes — het bevestigen van interacties tussen receptoren, adaptereiwitten en kinases binnen een signaalcascade.
• Eiwitcomplexvorming — het aantonen van subeenheidinteracties binnen multi-eiwitcomplexen, zoals transcriptiefactorcomplexen of chromatine-remodeling-complexen.
• Validatie van interacties uit screeningmethoden — het bevestigen van kandidaten uit Y2H- of massaspectrometrie-gebaseerde interactoomstudies in de endogene cellulaire context.
• Farmacologisch onderzoek — het beoordelen van het effect van een geneesmiddel of mutatie op het al dan niet vormen van een eiwitcomplex.

Voordelen en beperkingen

Gerelateerde technieken

Co-IP wordt vrijwel altijd gevolgd door western blot als uitlezing, en de voorafgaande eiwitscheiding via SDS-PAGE is uitgebreid beschreven onder gelelektroforese. Voor de identificatie van onbekende interactiepartners na cross-linking-IP is massaspectrometrie de aangewezen analysemethode. Voor de scheiding van intacte eiwitcomplexen zonder voorafgaande denaturatie, als aanvulling op co-IP, biedt het artikel over proteomics en 2D-PAGE achtergrond over blue-native PAGE. Voor antilichaam-gebaseerde kwantificering van eiwitten in oplossing in plaats van eiwitinteracties is ELISA de geschiktere techniek. Voor de analyse van eiwit-DNA-interacties in plaats van eiwit-eiwit-interacties is chromatine-immunoprecipitatie (ChIP) de aanvullende methode.

Veelgestelde vragen

Wat is het verschil tussen IP en co-IP?

Bij gewone immunoprecipitatie (IP) is het doel het isoleren en bevestigen van één specifiek eiwit zelf. Bij co-immunoprecipitatie (co-IP) wordt diezelfde isolatietechniek gebruikt om aan te tonen dat een tweede eiwit, de prey, samen met het doeleiwit (het bait) in een complex aanwezig is. De uitvoering is identiek; het verschil zit in het doel en de interpretatie van het resultaat.

Wat is het verschil tussen co-IP en Y2H?

Yeast two-hybrid (Y2H) is een gistgebaseerd screeningsysteem waarmee op grote schaal naar onbekende interactiepartners van een bait-eiwit kan worden gezocht, los van de oorspronkelijke celcontext. Co-IP test of een vermoede interactie daadwerkelijk optreedt in het endogene eiwitmilieu van de cel waarin het eiwit normaal voorkomt. Y2H is daarom typisch een ontdekkingsmethode, co-IP een bevestigingsmethode; interacties gevonden via Y2H worden doorgaans pas als betrouwbaar beschouwd na bevestiging met co-IP.

Wat zijn de toepassingen van co-IP?

Co-IP wordt breed ingezet in de cel- en moleculaire biologie. De belangrijkste toepassingen zijn het bevestigen van interacties tussen receptoren, adaptereiwitten en kinases binnen signaaltransductieroutes, het aantonen van subeenheidinteracties in multi-eiwitcomplexen zoals transcriptiefactorcomplexen of chromatine-remodeling-complexen, en de validatie van kandidaat-interacties die via screeningmethoden als yeast two-hybrid of massaspectrometrie zijn gevonden. Daarnaast wordt co-IP ingezet in farmacologisch onderzoek om te beoordelen of een geneesmiddel of mutatie de vorming van een eiwitcomplex beïnvloedt.

Wat is de betekenis van COIP?

COIP is een alternatieve schrijfwijze van co-IP, de afkorting voor co-immunoprecipitatie. Beide aanduidingen verwijzen naar dezelfde techniek: een methode waarbij een antilichaam tegen een bekend eiwit (het bait) wordt gebruikt om dat eiwit samen met zijn interactiepartners (de prey) uit een celextract neer te slaan, zodat een eiwit-eiwit-interactie in de native cellulaire context kan worden aangetoond.

Wat is het verschil tussen co-IP en pull-down?

Bij co-IP wordt een antilichaam gebruikt om het bait-eiwit te isoleren uit een native celextract; het experiment detecteert interacties in de endogene context van de cel. Bij een pull-down-assay (zoals GST- of His-tag pull-down) wordt een recombinant gezuiverd bait-eiwit met een affiniteitstag direct aan resin gebonden, waarna prey-eiwitten uit een celextract of een gezuiverde eiwitoplossing worden meegeprecipiteerd. Pull-down is daardoor minder afhankelijk van antilichaamkwaliteit en geeft een goed gedefinieerde bait-concentratie, maar mist de cellulaire context en post-translationele modificaties die de interactie in vivo kunnen beïnvloeden.

Hoe werkt immunoprecipitatie?

Immunoprecipitatie isoleert een specifiek molecuul uit een complex celextract via een antilichaam dat aan het molecuul bindt. Het antilichaam-doelmolecuul-complex wordt vervolgens uit de oplossing gehaald via binding aan protein A- of protein G-gecoate beads, magnetisch of agarose. Na meerdere wasstappen om niet-specifiek gebonden materiaal te verwijderen, wordt het complex van de beads geëlueerd voor verdere analyse, bijvoorbeeld via western blot.

Wat is het verschil tussen protein A en protein G bij co-IP?

Protein A en protein G zijn bacteriële eiwitten die beide aan de Fc-regio van antilichamen binden, maar met verschillende affiniteiten per antilichaamsoort en -subklasse. Protein A heeft een hoge affiniteit voor konijn-IgG en humaan IgG1, IgG2 en IgG4, maar bindt muis-IgG1 zwak. Protein G bindt breder: het heeft goede affiniteit voor muis-IgG1, muis-IgG2a, muis-IgG2b en rat-IgG. Voor co-IP met muismonoklonale antilichamen van subklasse IgG1 verdient protein G daarom de voorkeur; voor konijnenpolyklonale antilichamen is protein A voldoende. Commercieel verkrijgbaar protein A/G combineert de bindingseigenschappen van beide en is een praktische keuze wanneer de subklasse onbekend is.

Waarom is pre-clearing belangrijk bij co-IP?

Pre-clearing is een stap waarbij het celextract vóór de eigenlijke immunoprecipitatie wordt geïncubeerd met "lege" protein A/G-beads zonder antilichaam. Sommige eiwitten in het celextract binden aspecifiek aan het beadmateriaal zelf, ongeacht welk antilichaam aanwezig is. Door deze eiwitten vooraf te verwijderen, wordt de achtergrond in de uiteindelijke co-IP verlaagd en wordt de kans op fout-positieve prey-signalen verminderd. Pre-clearing is met name belangrijk bij celextracten met een hoge eiwitconcentratie of bij het werken met zeer abundante eiwitten die de neiging hebben aan beads te kleven.

Wat is de lysisbuffer voor co-IP?

Voor co-IP wordt doorgaans een milde, niet-denaturerende buffer gebruikt, zoals NP-40 (0,5 %), CHAPS (1 %) of digitonin (1 %), aangevuld met protease- en eventueel fosfatase-inhibitoren. Deze buffers lyseren cellen voldoende zonder de native eiwit-eiwit-interactie tussen bait en prey te verbreken.

Hoeveel eiwit is nodig voor een co-IP?

Een standaard co-IP-experiment gebruikt 500 tot 1000 µg totaaleiwit per reactie, gecombineerd met 1 tot 5 µg primair antilichaam. De exacte hoeveelheid hangt af van de expressieabundantie van het bait-eiwit en de affiniteit van het antilichaam. Bij laag-abundante eiwitten kan het nodig zijn de inzet op te schalen naar 1 tot 5 mg totaaleiwit, of over te stappen op een gevoeliger detectiesysteem voor de western blot. Van het totale inzetvolume wordt standaard 1 tot 5 % opzij gezet als input-fractie voor de western blot.

Wanneer gebruik je cross-linking bij co-IP?

Cross-linking vóór lysis wordt toegepast wanneer de te onderzoeken eiwit-eiwit-interactie zwak, kortlevend of transiënt is en de lysis- en wascondities niet overleeft. Typische toepassingen zijn kinase-substraatcontacten, GTPase-effectorbindingen en transcriptiefactor-co-activatorcomplexen. Formaldehyde (1 %) is het meest gebruikte cross-linker-reagens en wordt na 10 minuten op intacte cellen afgeblusd met glycine. Cross-linking wordt niet standaard toegepast bij stabiele, stoichiometrische complexen, omdat het de efficiëntie van elutie kan verminderen en de interpretatie van het experiment complexer maakt.

Wat zijn de controlevariabelen voor het IP-experiment?

De belangrijkste controles bij co-IP zijn een IgG-isotype-controle (een irrelevant antilichaam van dezelfde soort en subklasse), een beads-only-controle zonder antilichaam, een reverse co-IP met de prey als nieuw bait, en idealiter een knockout- of knockdown-controle van bait of prey. Deze controles samen onderscheiden een echte interactie van aspecifieke binding aan beads of antilichaam.

Waarom wordt IgG als controle gebruikt bij immunoprecipitatie?

Een irrelevant IgG-antilichaam van dezelfde soort en subklasse als het primaire antilichaam wordt gebruikt om aspecifieke binding in kaart te brengen. Omdat elk antilichaam, ongeacht specificiteit, in zekere mate aspecifiek aan eiwitten of beads kan binden, toont een prey-signaal in de IgG-controle aan dat het signaal in het echte experiment (deels) door aspecifieke binding wordt veroorzaakt in plaats van door een werkelijke interactie met het bait.

Wat is input bij een western blot?

Input is de fractie van het celextract die opzij wordt gezet vóór de immunoprecipitatie, doorgaans 1 tot 5 % van het totale lysaat. Deze fractie wordt direct op de western blot geladen als referentie: zij bewijst dat het doeleiwit en de vermoede interactiepartner aanwezig zijn in het uitgangsmateriaal en toont de verwachte bandgrootte, onafhankelijk van het resultaat van de precipitatiestap zelf.

Wat is het verschil tussen co-IP en RIP?

Co-IP (co-immunoprecipitatie) en RIP (RNA-immunoprecipitatie) volgen hetzelfde precipitatie-principe via een antilichaam, maar richten zich op een ander type moleculaire interactie. Bij co-IP wordt een eiwitcomplex neergeslagen om een eiwit-eiwit-interactie aan te tonen; het eindproduct dat wordt geanalyseerd is een eiwit, via western blot of massaspectrometrie. Bij RIP wordt een eiwit-RNA-interactie onderzocht: het neergeslagen RNA wordt geanalyseerd via RT-qPCR of RNA-sequencing om te bepalen welke RNA-moleculen met het bait-eiwit geassocieerd zijn. RIP vereist speciale voorzorgsmaatregelen om RNA-degradatie door RNases te voorkomen, waaronder RNase-inhibitoren in de lysisbuffer.

Wat is de RIPA-buffer voor immunoprecipitatie?

RIPA-buffer is een relatief stringente lysisbuffer die naast NP-40 ook SDS (0,1 %) en natriumdeoxycholaat bevat. Deze stringentie maakt RIPA-buffer effectief voor het volledig oplosbaar maken van eiwitten bij gewone IP, maar minder geschikt voor co-IP: de combinatie van detergentia is vaak te denaturerend en breekt zwakkere eiwit-eiwit-complexen af voordat het antilichaam de kans krijgt te binden. Voor co-IP wordt daarom doorgaans gekozen voor mildere buffers zoals NP-40, CHAPS of digitonin.

Voor co-IP-experimenten en aanverwante moleculaire technieken vindt u bij Labvakhandel centrifugebuizen en reactievaatjes voor monstervoorbereiding, biotechnologie- en moleculaire biologieapparatuur en pipetten voor nauwkeurige monsterhandling. Neem contact op voor advies over de juiste verbruiksartikelen voor uw co-IP-experiment.

Disclaimer: De informatie in dit artikel is bedoeld als algemene technische toelichting. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl aanvaardt geen aansprakelijkheid voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische, klinische of industriële situaties. Raadpleeg voor uw eigen toepassing altijd de geldende normen, vakliteratuur en de documentatie van fabrikant en apparatuur.