Amperometrische detectie is een elektrochemische detectiemethode waarbij de stroom wordt gemeten die ontstaat wanneer een electroactieve analyt op een werkende elektrode bij een vaste potentiaal wordt geoxideerd of gereduceerd. In de analytische chemie wordt de techniek op twee fundamenteel verschillende manieren toegepast: als HPLC-detector (elektrochemische detector, ECD) voor de uiterst gevoelige bepaling van neurotransmitters, fenolen en koolhydraten na chromatografische scheiding, en als transducerprincipe in biosensoren, waarbij een biologisch herkenningselement — doorgaans een enzym zoals glucose-oxidase — de selectiviteit levert en de elektrode de concentratie omzet in een meetbaar stroomsignaal. Dit artikel behandelt de celconfiguraties voor HPLC-ECD, het principe van gepulste amperometrische detectie (PAD), de drie generaties glucosebiosensoren met hun mediatorsystemen en de belangrijkste toepassingsgebieden.
Zie het overkoepelende artikel over amperometrie en impedantiespectroscopie voor de algemene theorie, de Cottrell-vergelijking, het drie-elektrodensysteem en de vergelijking met andere elektrochemische technieken.
Een elektrochemische detector (ECD) voor HPLC is in wezen een amperometrische meetcel die in-line na de scheidingskolom is geplaatst. Het eluaat stroomt continu langs een werkende elektrode die op een vast potentiaal staat ingesteld; elke electroactieve component die de cel passeert ondergaat oxidatie of reductie, en de resulterende stroom wordt geregistreerd als piek in het chromatogram. De gevoeligheid van HPLC-ECD ligt doorgaans in het sub-nanomol- tot picomolair-bereik en overtreft daarmee UV/Vis-detectie voor electroactieve verbindingen met een tot drie ordes van grootte.
Er bestaan twee hoofdtypen stroomcel voor amperometrische HPLC-detectie, elk met specifieke voor- en nadelen:
Beide celtypen maken gebruik van een drie-elektrodensysteem met een werkende elektrode (glassy carbon, goud of platina), een Ag/AgCl-referentie-elektrode en een roestvrij-stalen of platina tegenelektrode. De keuze van het werkende-elektrodemateriaal wordt bepaald door de analyt: glassy carbon is de standaard voor catecholaminen en fenolen, terwijl goud de voorkeur verdient bij gepulste amperometrische detectie van koolhydraten.
Bij UV/Vis-detectie wordt de absorptie van licht door de analyt gemeten; de techniek vereist dat de verbinding een chromofoor bezit die licht absorbeert bij de ingestelde golflengte. Bij amperometrische detectie wordt juist de stroom gemeten die ontstaat door oxidatie of reductie van de analyt op een elektrodeoppervlak. Amperometrische detectie is daardoor selectief voor electroactieve verbindingen — stoffen met oxideerbare of reduceerbare functionele groepen, zoals hydroxylgroepen in catecholaminen of aminogroepen in aminozuren — en biedt voor deze verbindingen doorgaans een hogere gevoeligheid dan UV-detectie. Omgekeerd kan UV-detectie worden toegepast op een breder scala aan verbindingen, waaronder niet-electroactieve stoffen. Een diode-array-detector (DAD) biedt bovendien spectrale informatie voor piekidentificatie, wat een ECD niet levert.
Bij eenvoudige (statische) amperometrie kan het oppervlak van de werkende elektrode na verloop van tijd vervuilen door adsorptie van oxidatieproducten, waardoor de gevoeligheid afneemt. Dit probleem is bijzonder uitgesproken bij de detectie van koolhydraten en aminozuren, die onomkeerbaar oxideerbare producten op het elektrodeoppervlak achterlaten. Gepulste amperometrische detectie (PAD, ook wel pulsed amperometric detection) lost dit op door een cyclisch driestappenpotentiaalprogramma toe te passen:
De volledige cyclus herhaalt zich typisch elke 0,5 tot 1 seconde. Door deze continue elektrochemische reiniging levert PAD een stabiel, reproduceerbaar signaal over duizenden injecties, zonder handmatige elektrodepolijsting.
Bij conventionele PAD wordt uitsluitend de anodische stroom tijdens de meetstap geregistreerd. Geintegreerde gepulste amperometrische detectie (IPAD, integrated pulsed amperometric detection) integreert de stroom ook tijdens extra potentiaalstappen in het positievere bereik. Dit vergroot de respons voor aminozuren en aminen aanzienlijk, omdat deze verbindingen pas bij hogere potentialen volledig oxideren. IPAD maakt het mogelijk om aminozuren en koolhydraten in een enkele chromatografische run te detecteren zonder derivatisering — een belangrijk voordeel ten opzichte van methoden die pre- of post-column derivatisering vereisen, zoals OPA- of ninhydrine-reacties.
PAD is bij uitstek geschikt voor verbindingen die geen of nauwelijks UV-absorptie vertonen en daarmee niet of slecht detecteerbaar zijn met een standaard UV/Vis-detector. De belangrijkste toepassingsgebieden zijn:
De combinatie van omgekeerde-fase-HPLC met statische amperometrische detectie op een glassy-carbon-elektrode is al sinds de jaren tachtig de gouden standaard voor de kwantificering van catecholaminen en indolaminen in biologische monsters. De techniek wordt in de vakliteratuur doorgaans aangeduid als HPLC-ECD (High Performance Liquid Chromatography with Electrochemical Detection).
De volgende verbindingen en metabolieten worden routinematig bepaald via HPLC-ECD:
HPLC-ECD wordt toegepast in neurochemisch onderzoek (microdialyse-experimenten), klinische diagnostiek (bepaling van catecholaminen in plasma en urine bij feochromocytoom en neuroblastoom) en in de voedingsmiddelensector (biogene aminen zoals histamine en tyramine). De techniek vereist zorgvuldige monstervoorbereiding — vaak met solid-phase-extractie (SPE) of vloeistof-vloeistofextractie — en een stabiele, pulsatievrije HPLC-pomp om de basislijnnoise zo laag mogelijk te houden.
De amperometrische glucosesensor is het meest verspreide voorbeeld van een elektrochemische biosensor en vormt de basis van alle draagbare bloedglucosemeters. Het werkingsprincipe combineert de selectiviteit van een enzym (glucose-oxidase of glucosedehydrogenase) met de kwantitatieve respons van een amperometrische elektrode. In de afgelopen vijftig jaar zijn drie generaties biosensoren ontwikkeld, elk met een ander mechanisme voor elektronoverdracht van het enzym naar de elektrode.
De indeling in generaties beschrijft de manier waarop de elektronen die bij de enzymatische oxidatie van glucose vrijkomen, worden overgedragen naar de werkende elektrode:
Glucose-oxidase katalyseert de oxidatie van glucose tot gluconolacton, waarbij de cofactor FAD wordt gereduceerd tot FADH₂. In de eerste generatie wordt FADH₂ vervolgens gereoxideerd door moleculaire zuurstof (O₂), die daarbij wordt omgezet in waterstofperoxide (H₂O₂). Het H₂O₂ wordt amperometrisch gedetecteerd op een platina- of koolstofelektrode bij een relatief hoge potentiaal (+0,6 tot +0,7 V vs. Ag/AgCl). De gemeten stroom is evenredig met de glucoseconcentratie. Dit ontwerp, gebaseerd op het Clark-elektrodeprincipe, heeft twee nadelen: de meting is afhankelijk van de lokale zuurstofconcentratie, en de hoge detectiepotentiaal maakt de sensor gevoelig voor interferentie door andere oxideerbare stoffen in bloed, zoals ascorbinezuur (vitamine C), urinezuur en paracetamol.
In de tweede generatie wordt zuurstof als elektronacceptor vervangen door een kunstmatige redoxmediator: een kleine, reversibel oxideerbare en reduceerbare verbinding die de elektronen van het gereduceerde enzym opneemt en ze bij een aanzienlijk lagere potentiaal (+0,1 tot +0,3 V) afgeeft aan de werkende elektrode. Dit elimineert de zuurstofafhankelijkheid en verlaagt de interferentie doordat de detectiepotentiaal nu onder de oxidatiepotentiaal van veel storende verbindingen ligt.
Veelgebruikte mediatoren zijn:
Het merendeel van de huidige commerciele bloedglucosemeters — de teststrips met een druppel capillair bloed — is gebaseerd op tweede-generatietechnologie met ferroceen- of osmiumderivaten als mediator op een screen-printed koolstofelektrode.
Bij de derde generatie wordt noch zuurstof noch een externe mediator gebruikt. In plaats daarvan is het enzym zodanig op het elektrodeoppervlak geimmobiliseerd — vaak via nanostructurering met koolstofnanobuisjes, grafeen of goudnanodeeltjes — dat de elektronen rechtstreeks van het actieve centrum van het enzym naar de elektrode worden overgedragen (direct electron transfer, DET). Dit levert de hoogste selectiviteit en de laagste detectiepotentiaal op, maar stelt hoge eisen aan de orientatie en afstand van het enzym ten opzichte van het elektrodemateriaal. DET-gebaseerde sensoren zijn nog overwegend in de onderzoeksfase; voor glucose wordt in dit verband vaak glucosedehydrogenase (GDH) gebruikt in plaats van glucose-oxidase, omdat de FAD-cofactor van GDH-varianten soms gunstiger is gepositioneerd voor directe elektronoverdracht.
Een moderne bloedglucosemeter bestaat uit een draagbaar elektronisch uitleesapparaat en een wegwerp-screen-printed elektrodenstrip. De strip bevat drie ge-integreerde elektroden — werkende elektrode, referentie-elektrode en tegenelektrode — geprint op een kunststofdrager. Op de werkende elektrode is het enzym (glucose-oxidase of GDH) samen met een redoxmediator (doorgaans een ferroceenderivaat) aangebracht in een gedroogde reagenslaag. Bij het aanbrengen van een druppel capillair bloed (circa 0,3-1 uL) lost het reagens op, oxideert het enzym de glucose en draagt de mediator de elektronen over naar de elektrode. De meter legt een vaste potentiaal aan, meet de resulterende stroom en berekent via een fabrieks-ijkcurve de glucoseconcentratie, die binnen 5 seconden op het display verschijnt.
Continue glucosemonitoringsystemen (CGM) gebruiken een subcutaan ingebrachte naaldvormige elektrochemische sensor die elke 1 tot 5 minuten de glucoseconcentratie in de interstitiele vloeistof meet. De sensor werkt op basis van amperometrische detectie met een geimmobiliseerd enzym en een redoxmediator (bij veel systemen een osmium-polypyridine-polymeercomplex) of op basis van eerste-generatiechemie met een waterstofperoxide-selectief membraan. CGM-sensoren hebben doorgaans een draagduur van 7 tot 14 dagen en worden gekalibreerd via periodieke vingerprikmetingen met een conventionele bloedglucosemeter, hoewel nieuwere systemen fabrieksgekalibreerd zijn en geen vingerprik meer vereisen.
De keuze van het werkende-elektrodemateriaal bepaalt het potentiaalvenster, de achtergrondstroom en de gevoeligheid voor specifieke analyten. Naast het bulkmateriaal wordt het elektrodeoppervlak in biosensor- en detectortoepassingen vaak gemodificeerd om selectiviteit, gevoeligheid of stabiliteit te verbeteren:
Oppervlaktemodificaties omvatten onder meer nafioncoatings (kationenuitwisselingsmembraan dat anionische interferenten zoals ascorbinezuur en urinezuur uitsluit), permselectieve cellulose-acetaatlagen en nanogestructureerde materialen zoals koolstofnanobuisjes en gereduceerd grafeenoxide die het effectieve elektrodeoppervlak vergroten en de gevoeligheid verhogen.
Bepaling van catecholaminen en metabolieten in plasma, urine en microdialysaat bij de diagnostiek van feochromocytoom, neuroblastoom en neurodegeneratieve aandoeningen. Glucose- en lactaatmonitoring via amperometrische point-of-care-sensoren.
Kwantificering van koolhydraten (glucose, fructose, sucrose, maltose) en suikeralcoholen via HPAEC-PAD na scheiding op een anionenwisselaarkolom. Bepaling van biogene aminen (histamine, tyramine, cadaverine) in vis, kaas en wijn via HPLC-ECD.
Gehalte- en zuiverheidsbepaling van aminoglycoside-antibiotica (gentamicine, tobramycine, amikacine) die geen UV-chromofoor bezitten, via HPLC-PAD op een gouden elektrode. Stabiliteitsonderzoek van electroactieve geneesmiddelen conform richtlijnen voor methodevalidatie.
Amperometrische sensoren voor opgeloste zuurstof (Clark-elektrode) bij waterkwaliteitsmonitoring en bij de bepaling van de biochemische zuurstofvraag (BZV). Detectie van fenolische microverontreinigingen via HPLC-ECD.
Online glucosemeting in fermentatieprocessen via amperometrische flow-through-enzymsensoren. Monitoring van metabolietprofielen tijdens celkweek in combinatie met metabolomics-workflows.
Amperometrische detectie is een elektrochemische meettechniek waarbij een werkende elektrode op een vaste potentiaal wordt gehouden en de stroom wordt gemeten die ontstaat door de oxidatie of reductie van een electroactieve stof. De gemeten stroom is recht evenredig met de concentratie van de analyt. De techniek wordt zowel als HPLC-detector (ECD) ingezet als in biosensoren, waaronder de bloedglucosemeter. Zie het basisartikel over amperometrie en impedantiespectroscopie voor de algemene theorie.
Bij amperometrische detectie wordt slechts een fractie (circa 5-10 %) van de analyt in de meetcel omgezet en wordt de stroom als signaal gebruikt. Bij coulometrische detectie wordt de analyt daarentegen volledig (100 %) geconverteerd en wordt de totale lading (coulombs) als meetsignaal gebruikt. Coulometrische detectie is daardoor onafhankelijk van het debiet en levert een absoluut signaal, maar vereist een cel met grotere elektrodeoppervlakken en langere verblijftijden.
Een redoxmediator is een klein, reversibel oxideerbaar en reduceerbaar molecuul dat als elektronshuttle fungeert tussen het actieve centrum van een enzym en het oppervlak van de werkende elektrode. De mediator neemt elektronen op van het gereduceerde enzym en geeft ze bij een gecontroleerde, lage potentiaal af aan de elektrode. Veelgebruikte mediatoren in glucosebiosensoren zijn ferroceenderivaten, osmium-polypyridinecomplexen en Pruisisch blauw. Door het gebruik van een mediator kan de detectiepotentiaal aanzienlijk worden verlaagd, wat interferentie door andere oxideerbare stoffen in het monster (zoals ascorbinezuur en urinezuur) sterk vermindert.
Glucose-oxidase (GOx) is het klassieke enzym voor glucosebiosensoren. GOx gebruikt zuurstof als natuurlijke elektronacceptor, waardoor de meting in eerste-generatiesensoren zuurstofafhankelijk is. Glucosedehydrogenase (GDH) gebruikt geen zuurstof maar een cofactor (PQQ, FAD of NAD⁺) als elektronacceptor, waardoor GDH-gebaseerde sensoren niet worden beinvloed door variaties in de zuurstofconcentratie van het monster. GDH-PQQ-sensoren zijn daarentegen gevoeliger voor interferentie door andere suikers (maltose, galactose), wat klinisch relevant kan zijn bij patienten die maltose-bevattende infuusvloeistoffen ontvangen. De keuze tussen GOx en GDH is daarom altijd een afweging tussen zuurstofongevoeligheid en suikerspecificiteit.
Ja — amperometrische detectie wordt ook gekoppeld aan capillaire elektroforese (CE-AD) voor de detectie van electroactieve verbindingen na elektroforetische scheiding. De techniek biedt een gevoelig alternatief voor UV-detectie bij CE, maar vereist een zorgvuldige ontkoppeling van het scheidingsveld en het detectiesignaal om interferentie door het hoge elektroforese-voltage te voorkomen.
Catecholaminen zoals dopamine, noradrenaline en adrenaline bevatten een catecholgroep (1,2-dihydroxybenzeen) die bij een relatief lage potentiaal (+0,6 tot +0,75 V) gemakkelijk en reversibel oxideert op een glassy-carbon-elektrode. De resulterende faradaische stroom levert een signaal met een aanzienlijk hogere signaal-ruisverhouding dan de UV-absorptie van dezelfde verbinding, waardoor detectielimieten in het picomolair-bereik haalbaar zijn. UV-detectie van catecholaminen is bovendien gevoeliger voor matrixinterferentie door co-eluerende UV-absorberende verbindingen.
Een standaard HPLC-ECD werkt amperometrisch: de potentiaal van de werkende elektrode is vast en de stroom wordt als functie van de tijd geregistreerd. Een voltammetrische detector varieert de potentiaal cyclisch of stapsgewijs en registreert de stroom als functie van de potentiaal. Voltammetrische detectie (met name coulometrische array-detectie, waarbij meerdere elektroden op verschillende potentialen worden ingesteld) levert meer selectiviteit en piekzuiverheidsinformatie, maar is instrumenteel complexer. Zie het artikel over voltammetrie voor het achterliggende principe.
Screen-printed elektroden (SPE's) zijn elektroden die via zeefdruk (screen printing) als dunne, gepatroneerde lagen van geleidend materiaal (koolstof, goud, platina) op een kunststof- of keramische drager worden aangebracht. Een complete SPE bevat doorgaans de werkende elektrode, de referentie-elektrode en de tegenelektrode op een enkele strip van enkele vierkante centimeters. SPE's zijn goedkoop, reproduceerbaar en geschikt voor eenmalig gebruik, wat ze ideaal maakt voor point-of-care-diagnostiek, milieuveldmetingen en biosensortoepassingen. De werkende elektrode kan vooraf worden gemodificeerd met enzymen, mediatoren, antilichamen of nanomaterialen voor specifieke detectietoepassingen.
Elektrodevervuiling (fouling) is een van de belangrijkste praktische uitdagingen bij amperometrische detectie. Er zijn verschillende strategieen om fouling te beheersen: gepulste amperometrische detectie (PAD), waarbij het elektrodeoppervlak cyclisch elektrochemisch wordt gereinigd en gereactiveerd; het aanbrengen van een permselectief membraan (nafion, cellulose-acetaat) dat macromoleculen en eiwitten van het elektrodeoppervlak weert; periodieke elektrochemische of mechanische polijsting van de werkende elektrode; en het gebruik van wegwerpelektroden (SPE's) die na elke meting worden vervangen.
Labvakhandel levert elektrochemie- en pH-apparatuur (potentiostaten, elektroden, meetcellen), chromatografie-apparatuur voor HPLC-opstellingen, chromatografiematerialen en teststrips en indicatoren waaronder glucose-urineteststrips. Neem contact op voor advies over de juiste materialen voor uw amperometrische detectie- of biosensortoepassing.
Disclaimer: De informatie in dit artikel is bedoeld als algemene technische toelichting. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl aanvaardt geen aansprakelijkheid voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische, klinische of industriële situaties. Raadpleeg voor uw eigen toepassing altijd de geldende normen, vakliteratuur en de documentatie van fabrikant en apparatuur.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
