De eiwit-eiwit interactie proximity ligation assay (PLA) — in de handel bekend onder de merknaam Duolink — is een moleculairbiologische techniek waarmee twee eiwitten die zich binnen circa 40 nm van elkaar bevinden zichtbaar worden gemaakt als afzonderlijke fluorescente puntjes in vaste cellen of weefselcoupes. De methode combineert de specificiteit van twee primaire antilichamen met de gevoeligheid van isotherme DNA-amplificatie en levert daarmee een in situ beeld van endogene eiwit-eiwit interacties, post-translationele modificaties en eiwitcomplexen op enkelvoudig-molecuulniveau. PLA werd in 2006 gepubliceerd door Ola Söderberg en collega's en is sindsdien uitgegroeid tot een standaardtechniek in de celbiologie, immunologie en oncologisch onderzoek.
Terminologie — twee verschillende PLA-technieken. De term "proximity ligation assay" wordt in de literatuur voor twee heel verschillende methoden gebruikt. Dit artikel behandelt de eiwit-eiwit interactie PLA van Söderberg (2006), commercieel als Duolink verkrijgbaar. De andere familie — 3C, 4C, 5C en Hi-C — gebruikt eveneens ligatie in nabijheid maar meet DNA-DNA contacten binnen chromatine; die technieken staan beschreven in proximity ligation assays: 3C, Hi-C en 3D-genoomstructuur.
De proximity ligation assay is een immunodetectiemethode die alleen een signaal genereert wanneer twee doeleiwitten fysiek dicht bij elkaar liggen. In tegenstelling tot conventionele immunofluorescentie, waarbij elk eiwit afzonderlijk zichtbaar wordt gemaakt en co-lokalisatie op pixelniveau moet worden geïnterpreteerd, koppelt PLA de detectie zelf aan het nabijheidscriterium: geen nabijheid, geen signaal. Elke fluorescente stip die uiteindelijk onder de fluorescentiemicroscoop zichtbaar is, komt overeen met één individueel eiwitpaar. Die één-op-één-relatie maakt kwantificering mogelijk door simpelweg de puntjes per cel te tellen.
De techniek werkt in gefixeerde monsters — meestal met paraformaldehyde behandelde cellen op dekglaasjes of formaline-gefixeerde, paraffine-ingebedde (FFPE) weefselcoupes — en detecteert endogene eiwitten zonder genetische modificatie van de cel. Daarmee vult PLA een leemte tussen technieken zoals FRET (die gefuseerde fluorescente eiwitten vereist) en co-immunoprecipitatie (die interacties bulkgewijs uit lysaten meet en de ruimtelijke context verliest).
Het protocol verloopt in vijf technische fasen, weergegeven in bovenstaand schema.
Twee primaire antilichamen worden op het gefixeerde monster gebracht: één tegen eiwit A, één tegen eiwit B. Cruciaal is dat de twee antilichamen uit verschillende gastheersoorten afkomstig zijn — bijvoorbeeld één uit konijn en één uit muis — zodat de daaropvolgende soort-specifieke PLA-probes ze onafhankelijk van elkaar kunnen herkennen. De incubatie- en blocking-stappen zijn identiek aan die van standaard immunofluorescentie: verzadigingsbuffer met normaal serum, incubatie doorgaans overnacht bij 4 °C, en spoelen in PBS met detergent.
Vervolgens worden twee secundaire antilichamen toegevoegd — de PLA-probes — die elk gekoppeld zijn aan een uniek, kort DNA-oligonucleotide (aangeduid als PLUS en MINUS). De secundaire antilichamen zijn soort-specifiek en binden zo elk hun eigen primaire antilichaam. Na deze stap draagt eiwit A een korte DNA-staart via het konijn-antilichaam en eiwit B een andere DNA-staart via het muis-antilichaam.
Twee kleine connector-oligonucleotiden worden toegevoegd. Deze zijn zo ontworpen dat ze alleen met beide PLA-probe-staarten kunnen hybridiseren als die staarten dicht genoeg bij elkaar liggen — de effectieve afstandsgrens ligt bij ongeveer 40 nm, wat overeenkomt met de karakteristieke afstand voor een directe eiwit-eiwit interactie of zeer nauwe co-lokalisatie in een complex. DNA-ligase sluit vervolgens de resulterende structuur tot een gesloten cirkelvormig DNA-molecuul. Zonder ruimtelijke nabijheid vindt geen hybridisatie plaats en wordt geen cirkel gevormd; er ontstaat dus geen substraat voor de vervolgstap.
φ29 DNA-polymerase — een isotherm werkend enzym met sterke strand-displacement-activiteit — gebruikt een van de PLA-probe-oligonucleotiden als primer en kopieert de DNA-cirkel honderden tot duizenden malen na. Het resultaat is een lange, opgekrulde eenstrengs DNA-streng met honderden tandemherhalingen van de cirkelsequentie, die fysiek verankerd blijft aan de interactieplaats.
Fluorescent gelabelde detectie-oligonucleotiden hybridiseren aan de gerepeteerde sequenties in het RCA-product. Doordat honderden fluoroforen op één plek geconcentreerd worden, verschijnt elke interactie als een helder, diffractie-begrensd punt (~1 µm) dat met een standaard fluorescentiemicroscoop of confocale microscoop zichtbaar en telbaar is. De kernkleuring gebeurt gewoonlijk met DAPI voor toewijzing van signalen aan individuele cellen.
De effectieve nabijheidsgrens van PLA — meestal geciteerd als 30 tot 40 nanometer — wordt bepaald door de lengte van de twee antilichamen (elk ~15 nm) plus de lengte van de aan hen gekoppelde oligonucleotide-staarten. Alleen wanneer beide oligo-uiteinden binnen deze reikwijdte samenkomen, kunnen ze samen met de connectors een sluitbare cirkel vormen. Deze afstand is fysisch relevant: directe eiwit-eiwit interacties spelen zich meestal af op enkele nanometers, terwijl eiwitten binnen hetzelfde multiproteïnecomplex tot enkele tientallen nanometers uit elkaar kunnen liggen. Interacties op grotere afstand — bijvoorbeeld tussen eiwitten die zich toevallig in hetzelfde subcompartiment bevinden — leveren geen signaal en worden zo automatisch uitgesloten.
PLA is bijzonder krachtig voor het bestuderen van dynamische eiwitinteracties in signaaltransductiepathways, zoals receptor-adapter binding na ligand-stimulatie, kinase-substraat complexen, of de assemblage van transcriptiefactorcomplexen. Doordat de techniek endogene eiwitten in hun natuurlijke cellulaire context meet, blijven concentratieverhoudingen, sub-cellulaire lokalisatie en post-translationele status behouden — informatie die verloren gaat bij lysaat-gebaseerde methoden.
Een tweede grote toepassingscategorie is de detectie van post-translationele modificaties: één primair antilichaam herkent het doeleiwit, het andere de specifieke modificatie (bijvoorbeeld een fosforylering, ubiquitinering of acetylering). Een positief PLA-signaal betekent dan dat op één en hetzelfde molecuul zowel het doel-epitoop als de modificatie aanwezig is. Zo kunnen fosforyleringsniveaus per cel worden gekwantificeerd — informatie die in Western-blot-experimenten wordt uitgemiddeld over de hele populatie.
Voor pathologisch onderzoek op tumorbiopten biedt PLA een manier om eiwitinteracties te kwantificeren die relevant zijn voor prognose of therapierespons. Voorbeelden zijn de HER2-HER3 dimerisatie in borstkanker en de detectie van receptor-tyrosinekinase-adaptor complexen. Doordat FFPE-materiaal geschikt is, kan de techniek worden toegepast op klinische archiefmonsters.
Traditionele biochemische methoden vereisen vaak overexpressie van gefusioneerde eiwitten om voldoende signaal te krijgen — met het risico op artefacten door niet-fysiologische concentraties. PLA levert een detecteerbaar signaal bij endogene expressieniveaus dankzij de exponentiële signaalversterking via RCA, waardoor ook laag-abundante of tijdelijke interacties in beeld komen.
Bij DNA-schade-onderzoek wordt PLA ingezet om de rekrutering van reparatie-eiwitten naar beschadigde DNA-plekken te visualiseren. Een primair antilichaam tegen γH2AX (marker van dubbelstrengs breuken) gecombineerd met een antilichaam tegen een kandidaat-reparatie-eiwit levert puntjes op waar beide samenkomen — een directe visualisatie van functionele co-lokalisatie op de schadeplek.
Co-immunoprecipitatie meet eiwit-eiwit interacties in cel-lysaten: het beoogde eiwit wordt met een antilichaam neergeslagen en interactiepartners worden op een gel of via massaspectrometrie gedetecteerd. De methode is uitstekend voor het identificeren van onbekende partners maar verliest de ruimtelijke informatie: waar in de cel interacties plaatsvinden, in hoeveel cellen ze voorkomen en of ze heterogeen zijn over een populatie blijft onzichtbaar. PLA behoudt die ruimtelijke informatie maar vereist dat men de twee interactiepartners van tevoren kent en dat er goede antilichamen tegen beide beschikbaar zijn. In de praktijk worden beide technieken vaak combinatief gebruikt: co-IP voor ontdekking, PLA voor bevestiging in situ.
FRET (Förster resonance energy transfer) meet energieoverdracht tussen twee fluoroforen die binnen circa 10 nm van elkaar liggen — dus op een kortere en scherpere afstand dan PLA. FRET vereist echter dat beide doeleiwitten als fluorescent fusie-eiwit tot expressie worden gebracht, wat genetische modificatie van de cel impliceert en niet toepasbaar is op klinisch weefsel. PLA werkt op endogene eiwitten zonder modificatie, maar met een groter (30–40 nm) en minder scherp gedefinieerd afstandsvenster.
Yeast two-hybrid systemen sporen interacties op in gistcellen na expressie van chimere eiwitten met een DNA-bindings- en een transactivatiedomein. De techniek is krachtig voor genoombrede interactoom-screens maar meet interacties buiten hun natuurlijke cellulaire context en levert veel vals-positieven op. PLA is complementair: bruikbaar voor validatie van Y2H-hits in de doelcel.
Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) en verwante split-eiwit-benaderingen brengen twee complementaire helften van een fluorescent eiwit tot expressie, gefuseerd aan de doeleiwitten; alleen bij interactie ontstaat een fluorescerend complex. Net als bij FRET is genetische modificatie nodig, en de assemblage van het gereconstitueerde fluorescente eiwit is doorgaans irreversibel — wat interactie-dynamiek maskeert. PLA meet endogene interacties zonder deze beperkingen.
De specificiteit van het PLA-signaal staat of valt met de kwaliteit van de twee primaire antilichamen. Voorafgaande validatie via Western blot en immunofluorescentie op knockout- of knockdown-controles is essentieel. Antilichamen die in immunofluorescentie een schoon patroon geven, presteren doorgaans ook goed in PLA. Aan- en afwezigheid van signaal in respectievelijk positieve en negatieve controlecellen moet vaststaan voordat conclusies worden getrokken.
Fixatie beïnvloedt zowel de toegankelijkheid van epitopen als de nabijheid van eiwitten. Paraformaldehyde-fixatie (typisch 4% gedurende 10–15 minuten) behoudt de meeste epitopen; methanol-fixatie kan sommige eiwit-eiwit interacties denatureren. De permeabilisatiestap met Triton X-100 of saponine moet voldoende zijn voor antilichaamdiffusie zonder de subcellulaire architectuur te verstoren. Voor FFPE-materiaal is antigen retrieval (bijvoorbeeld door hittebehandeling in citraatbuffer) een noodzakelijke voorbereidingsstap.
Vier controles horen standaard in elk PLA-experiment: (1) beide primaire antilichamen weglaten (achtergrondsignaal van de PLA-probes en RCA-detectie), (2) elk primair antilichaam afzonderlijk weglaten (test voor niet-specifieke binding van één probe), (3) een technische positieve controle waar interactie bekend is, en (4) waar mogelijk een biologische negatieve controle (knockout, knockdown of stimulusafhankelijke afwezigheid). Alleen tegen deze achtergrond zijn puntaantallen interpreteerbaar.
Puntjes worden geteld per cel door beeldanalyse-software (Duolink ImageTool, CellProfiler of vergelijkbaar), waarbij de kernkleuring dient om cellen individueel te identificeren. Rapportage vindt meestal plaats als gemiddeld aantal PLA-signalen per cel met bijbehorende spreidingsmaat, waarbij tientallen tot honderden cellen per conditie worden geanalyseerd. Statistische vergelijking tussen condities vereist voldoende biologische replicaten; zie validatie van analytische methoden voor de algemene principes van methodevalidatie en reproduceerbaarheid.
De techniek heeft enkele intrinsieke beperkingen. Ten eerste geeft PLA geen absolute afstand tussen twee eiwitten — een positief signaal betekent alleen "binnen ~40 nm", niet dat er sprake is van directe fysieke binding. Twee eiwitten in hetzelfde complex zonder onderlinge binding kunnen even goed een signaal geven als een direct interagerend paar. Ten tweede is de detectie-efficiëntie niet 100%: niet elk werkelijk interactiepaar leidt tot een succesvolle cirkelvorming en RCA, dus de gemeten puntaantallen zijn ondermaats van het werkelijke aantal interacties. Ten derde vereist de techniek zorgvuldige normalisatie tussen experimenten omdat variaties in fixatie, antilichaamlot en RCA-efficiëntie invloed hebben op de absolute puntaantallen; interne referentiecondities per experiment zijn daarom noodzakelijk.
PLA staat niet op zichzelf maar past in een breder pakket aan technieken voor eiwit- en interactieonderzoek. Voor kwantificering van totaal eiwit blijven Bradford, BCA en A280 de standaard. Voor identificatie en semi-kwantitatieve detectie op eiwitmatrix-niveau blijft Western blot onvervangen. Voor massaal parallelle detectie in oplossing biedt ELISA hoge doorvoer. Voor cel-populatie-analyse van intracellulaire markers is flowcytometrie geschikt. PLA vult de niche van in situ, single-molecule, kwantitatieve interactiedetectie in de intacte cel. Voor hoog-resolutiebeeldvorming van sub-cellulaire structuren vult super-resolutiemicroscopie de resterende resolutiekloof.
Voor de uitvoering van PLA-experimenten in uw laboratorium vindt u het benodigde randmateriaal in ons assortiment: fluorescentie- en lichtmicroscopen voor beeldvorming, laboratoriumplastics en kweekplaten voor celkweek en fixatie, precisiepipetten voor buffer- en probeoverdracht, en apparatuur voor moleculaire biologie voor de amplificatie- en detectiestappen. Neem contact op voor advies over de configuratie die aansluit bij uw toepassing.
Disclaimer: dit artikel biedt algemene informatie over de proximity ligation assay voor eiwit-eiwit interacties. Voor de uitvoering van experimenten en interpretatie van resultaten geldt altijd de documentatie van de gebruikte reagentia (bijvoorbeeld Duolink-kits) en apparatuur, alsmede de geldende normen en vakliteratuur. De verantwoordelijkheid voor experimentele opzet, controlekeuze en interpretatie ligt bij de gebruiker en het laboratorium.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
