Het bepalen van de eiwitconcentratie is een van de meest uitgevoerde handelingen in het biochemisch en biomedisch laboratorium. Bij elke stap van een eiwitzuivering, bij het normaliseren van celextracten voor western blot of bij het controleren van fracties na affiniteitschromatografie is een betrouwbare concentratiebepaling vereist. De drie meest gebruikte methoden zijn de Bradford-assay (Coomassie-binding), de BCA-assay (bicinchoninezuurreductie) en directe UV-absorptie bij 280 nm (A280). Elk van deze methoden berust op een ander fysisch-chemisch principe, heeft eigen sterke punten en eigen gevoeligheden voor matrixstoffen.
Dit artikel vergelijkt de drie methoden op principe, gevoeligheid, lineair bereik, matrixcompatibiliteit en standaardcurve-opzet. Het doel is een praktische leidraad voor de methodekeuze op basis van monstertype en toepassing.
De Bradford-assay, beschreven door Marion Bradford in 1976, is de snelste van de drie methoden. Het principe berust op de binding van de kleurstof Coomassie Brilliant Blue G-250 aan eiwitten in zuur milieu. De kleurstof bestaat in drie vormen: een rode kationische vorm (absorptiemaximum 465 nm), een groene neutrale vorm en een blauwe anionische vorm (absorptiemaximum 595 nm). In het zure reagensmedium overheerst de rode vorm. Wanneer de kleurstof bindt aan basische en hydrofobe aminozuurresiduen — voornamelijk arginine, maar ook lysine, histidine en aromatische residuen — verschuift het evenwicht naar de stabiele blauwe anionische vorm. De toename van de absorptie bij 595 nm is evenredig met de hoeveelheid gebonden eiwit.
De Bradford-assay meet de hoeveelheid Coomassie-kleurstof die aan eiwitten bindt, niet de intrinsieke eigenschap van het eiwit zelf. De respons is daarom afhankelijk van de aminozuursamenstelling: eiwitten met veel arginine en hydrofobe residuen geven een sterkere kleurontwikkeling per microgram dan eiwitten met weinig van deze residuen. Dit verklaart waarom de keuze van de standaard (doorgaans bovine serum albumin, BSA, of immunoglobuline G) de gemeten concentratie van het onbekende eiwit beïnvloedt. Een meting ten opzichte van BSA kan tot 50 % afwijken van de werkelijke concentratie bij eiwitten met een sterk afwijkende aminozuurverdeling.
Een bijzonderheid van de Bradford-assay is dat de standaardcurve niet strikt lineair is. Bij hogere eiwitconcentraties buigt de curve af doordat de beschikbare kleurstof verzadigt. In de praktijk wordt de curve daarom beperkt tot het lineaire bereik (standaardprotocol: 100–1500 µg/mL) en worden monsters die buiten dit bereik vallen verdund. De micro-uitvoering (1–25 µg/mL) gebruikt een hoger reagens-monstervolume-verhouding en geeft een beter lineair bereik bij lagere concentraties. Een kwadratische of polynomial fit kan het werkbereik verruimen, maar vereist meer standaardpunten dan een lineaire regressie.
De belangrijkste storende factoren zijn detergentia. Ionische detergentia zoals SDS verstoren het kleurstofevenwicht en geven vals-hoge waarden doordat SDS-micellen de anionische kleurstofvorm stabiliseren. Niet-ionische detergentia (Triton X-100, Tween 20) storen boven circa 0,1 % (v/v). Reducerende agentia zoals dithiothreitol (DTT) en beta-mercaptoethanol interfereren daarentegen nauwelijks — een belangrijk voordeel ten opzichte van de BCA-assay. Sterk basische buffers (pH > 8) en hoge concentraties NaOH verstoren het zure milieu van het reagens en geven onbetrouwbare resultaten. Een praktische oplossing is het toepassen van een matrix-matched blanco: de blanco bevat dezelfde buffercomponenten en detergentia als het monster, zodat achtergrondabsorptie wordt gecorrigeerd.
De BCA-assay (bicinchoninic acid assay), ontwikkeld door Smith et al. in 1985, combineert twee reacties. In de eerste stap — de biuretreactie — reduceren peptidebindingen in alkalisch milieu Cu2+ tot Cu+. De hoeveelheid gereduceerd koper is evenredig met het aantal peptidebindingen en wordt aanvullend versterkt door de zijketens van cysteïne, tryptofaan, tyrosine en de peptidebinding zelf. In de tweede stap chelateert bicinchoninezuur (BCA) het gevormde Cu+ in een 2:1-complex (twee BCA-moleculen per Cu+-ion) dat intens paars kleurt met een absorptiemaximum bij 562 nm.
Omdat de kleurontwikkeling primair afhangt van peptidebindingen — en pas secundair van specifieke aminozuren — vertoont de BCA-assay minder eiwit-tot-eiwit variatie dan de Bradford-assay. De standaardcurve is over een breed bereik (20–2000 µg/mL) goed lineair, wat kwantificatie eenvoudiger maakt. De micro-uitvoering biedt een detectiegrens van circa 0,5 µg/mL.
De biuretreactie is de onderliggende koperreductiestap die de BCA-assay aandrijft. In alkalisch milieu (pH 11–11,25, gebufferd met natriumcarbonaat) coördineren peptidebindingen Cu2+-ionen via de stikstof- en carbonylzuurstofatomen van de hoofdketen. Het gevormde complex reduceert Cu2+ tot Cu+. De naam "biuretreactie" verwijst naar het organische molecuul biuret (NH2-CO-NH-CO-NH2), dat dezelfde kopercoördinatie vertoont en als modelverbinding dient. Elke peptidebinding draagt bij aan de reductie, waardoor de BCA-respons goed correleert met de totale eiwitmassa — ongeacht de tertiaire structuur of de specifieke aminozuursequentie.
De achilleshiel van de BCA-assay zijn reducerende agentia. DTT, beta-mercaptoethanol en TCEP reduceren zelf Cu2+ tot Cu+, wat een vals-hoog signaal genereert dat niet van de eiwitrespons te onderscheiden is. Boven 1 mM DTT is de storing aanzienlijk. Ook EDTA interfereert doordat het Cu2+ chelateert en daarmee aan de biuretreactie onttrekt. Reducerende suikers (glucose, fructose) geven eveneens vals-positieve signalen. Lipiden en sommige biopolymeren kunnen de kleurontwikkeling beïnvloeden. Detergentia worden daarentegen goed verdragen — tot 5 % SDS en tot 5 % Triton X-100 — wat de BCA-assay bij uitstek geschikt maakt voor lysaten die detergentia bevatten.
Wanneer reducerende agentia niet te vermijden zijn, kan een gelfiltratie of aceton-/TCA-precipitatie voorafgaand aan de assay de interferenten verwijderen. Bij precipitatie wordt het eiwit neergeslagen, gewassen en opgelost in een compatibele buffer. Het verlies aan eiwit door onvolledige resuspensie is het voornaamste nadeel van deze aanpak.
De directe meting van de UV-absorptie bij 280 nm is de enige reagensvrije methode onder de drie. De absorptie bij deze golflengte wordt veroorzaakt door de aromatische aminozuren tryptofaan (Trp, absorptiemaximum 279,8 nm, molaire extinctiecoëfficiënt ca. 5500 L·mol-1·cm-1), tyrosine (Tyr, absorptiemaximum 274,6 nm, ca. 1490 L·mol-1·cm-1) en in mindere mate fenylalanine (Phe, bijdrage verwaarloosbaar bij 280 nm). Disulfidebindingen (cystines) dragen eveneens licht bij aan de absorptie bij 280 nm.
De concentratie volgt rechtstreeks uit de wet van Lambert-Beer: A = ε × c × l. Wanneer de molaire extinctiecoëfficiënt (ε) van het eiwit bekend is — berekend uit de aminozuursequentie met de methode van Pace et al. of via online tools zoals ProtParam — is de concentratie direct uit de absorptie af te leiden zonder standaardcurve. Voor een onbekend eiwitmengsels wordt doorgaans een gemiddelde specifieke extinctie van E0,1% = 1,0 (1 mg/mL geeft A280 ≈ 1,0 in een 1 cm cuvet) als benadering gebruikt, maar de nauwkeurigheid hiervan varieert sterk per eiwit.
De A280-methode faalt in drie situaties. Ten eerste bij eiwitten met weinig of geen tryptofaan en tyrosine: de extinctiecoëfficiënt is dan zeer laag en de meting onnauwkeurig. Ten tweede bij aanwezigheid van nucleïnezuren: DNA en RNA absorberen sterk bij 260 nm, maar ook significant bij 280 nm. Zelfs 1 % nucleïnezuurcontaminatie kan een overschatting van de eiwitconcentratie met 10 % veroorzaken. De klassieke correctie volgens Warburg-Christian (1942) gebruikt de verhouding A280/A260 om de bijdrage van nucleïnezuren te compenseren, maar is slechts een benadering. Ten derde bij aanwezigheid van andere UV-absorberende stoffen in het buffer (imidazol bij IMAC-elutie, nucleotiden, sommige detergentia). Een meting in elutiebuffer met 250 mM imidazol geeft zonder correctie een forse overschatting.
Bij A280 wordt de intrinsieke UV-absorptie van aromatische aminozuren gemeten — er wordt geen reagens toegevoegd en het monster wordt niet verbruikt. Bij een reagensgebaseerde methode (Bradford of BCA) wordt een kleurreactie uitgevoerd die het eiwit chemisch modificeert of bindt, waarna de absorptie van het gevormde product wordt gemeten in het zichtbare bereik. A280 is sneller en niet-destructief, maar eiwitspecifiek en gevoelig voor nucleïnezuurcontaminatie. De reagensmethoden zijn universeler maar verbruiken monster en vereisen incubatietijd.
Zowel de Bradford- als de BCA-assay vereisen een standaardcurve (kalibratiecurve) met een eiwit van bekende concentratie. De keuze van de standaard en de uitvoering van de curve bepalen in hoge mate de nauwkeurigheid van de resultaten.
De twee meest gebruikte standaarden zijn BSA (bovine serum albumin) en immunoglobuline G (IgG). BSA is goedkoop, goed oplosbaar en geeft een sterke respons in zowel Bradford als BCA. De keerzijde is dat BSA een bovengemiddeld aantal Coomassie-bindende residuen heeft, waardoor Bradford-waarden ten opzichte van BSA de concentratie van veel andere eiwitten overschatten. IgG geeft een lagere respons per microgram en benadert daarmee het "gemiddelde eiwit" beter in de Bradford-assay. Voor de BCA-assay is het verschil tussen BSA en IgG kleiner, omdat de biuretreactie minder aminozuurspecifiek is.
De beste strategie is een standaard te kiezen die qua structuur en aminozuurverdeling zoveel mogelijk lijkt op het te meten eiwit. Voor gezuiverde eiwitten met bekende sequentie is A280 met de berekende extinctiecoëfficiënt vaak nauwkeuriger dan welke standaardcurve dan ook.
Een betrouwbare standaardcurve omvat minimaal vijf concentratiepunten, gelijk verdeeld over het lineaire bereik, plus een blanco (0 µg/mL). Elke standaard en elk monster wordt in duplo of triplo gemeten. De standaardoplossingen worden bereid door seriële verdunning van één stockoplossing in dezelfde buffer als het monster — niet in water, tenzij het monster ook in water is opgelost. De blanco bevat dezelfde buffercomponenten als de standaarden en monsters. Afwijking van de blancobuffer ten opzichte van de monsterbuffer is een van de meest voorkomende fouten en introduceert een systematische bias die door geen enkele regressie te corrigeren is.
Geen van de drie methoden is in alle situaties het nauwkeurigst. Voor een gezuiverd eiwit met bekende sequentie is A280 met de berekende extinctiecoëfficiënt doorgaans de meest accurate methode, omdat er geen standaardcurve-bias is en de meting direct op het eiwit zelf berust. Voor totaal eiwit in een complex mengsel (celextract, lysaat) is de BCA-assay het meest uniform, omdat de biuretreactie grotendeels onafhankelijk is van de aminozuursamenstelling. De Bradford-assay is de minst nauwkeurige in absolute zin, maar de snelste en de meest robuuste tegen reducerende agentia.
De monstermatrix — buffer, detergentia, reducerende agentia, zoutconcentratie, lipiden — is in de praktijk de bepalende factor bij de methodekeuze. Hieronder worden de meest voorkomende laboratoriumsituaties behandeld.
SDS is een ionisch detergens dat de Bradford-assay ernstig verstoort: het stabiliseert de anionische kleurstofvorm onafhankelijk van eiwit en geeft daarmee vals-hoge absorptiewaarden. De BCA-assay verdraagt SDS goed tot 5 % en is daarom de standaardkeuze voor eiwitbepaling in RIPA-buffer of andere SDS-bevattende lysisbuffers. A280 is eveneens mogelijk als het SDS-gehalte laag is (< 0,5 %), maar SDS absorbeert licht bij lage UV-golflengten en kan bij hoge concentraties een achtergrond genereren.
Imidazol absorbeert sterk bij 280 nm (absorptiemaximum rond 275 nm) en maakt A280-metingen onbruikbaar tenzij een zorgvuldige blancocorrectie met identieke imidazolconcentratie wordt uitgevoerd. Bij hoge imidazolconcentraties (250–500 mM) is de blancocorrectie onnauwkeurig door de hoge achtergrondabsorptie. Bradford en BCA worden niet of nauwelijks gestoord door imidazol tot ten minste 100 mM, waardoor beide methoden geschikt zijn voor IMAC-eluaten. Na een ontzouting of bufferuitwisseling via grootte-exclusiechromatografie of dialyse wordt A280 weer bruikbaar.
In ruw celextract zijn nucleïnezuren een veelvoorkomende contaminant. De Bradford-assay en de BCA-assay worden nauwelijks gestoord door nucleïnezuren en zijn daarom de aangewezen methoden voor ruwe lysaten. A280 geeft in aanwezigheid van nucleïnezuren een overschatting. De correctie van Warburg-Christian (eiwitconcentratie (mg/mL) = 1,55 × A280 – 0,76 × A260) biedt een benadering, maar is slechts betrouwbaar als alleen eiwit en nucleïnezuren bijdragen aan het absorptiespectrum. Een verbeterde benadering is de driegolflengtemethode (Scopes, 1974), die metingen bij 280 nm, 260 nm en 205 nm combineert.
Bradford- en BCA-assays worden uitgevoerd in het zichtbare bereik en zijn daarom compatibel met kunststof wegwerpcuvetten en polystyreen microplaten. De Bradford-kleurstof hecht echter aan kunststof en glas en kleurt cuvetten blauw na herhaald gebruik — wegwerpcuvetten zijn daarom de voorkeur. Microplaat-uitvoeringen (96-wells) zijn ideaal voor series met veel monsters en standaarden, gemeten met een plaatlezer. A280-metingen vereisen UV-doorlatend materiaal: kwartscuvetten of UV-transparante microplaten. Micro-volumeapparaten (Nanodrop-achtige instrumenten) meten A280 op een druppel van 1–2 µL zonder cuvet, wat ze bijzonder geschikt maakt voor controle van gezuiverde eiwitfracties.
Kant-en-klaar Bradford-reagens (zure Coomassie G-250-oplossing) is bij opslag op kamertemperatuur in het donker doorgaans meerdere maanden stabiel. Na toevoeging aan het eiwitmonster ontwikkelt de kleur zich binnen 2 minuten en is stabiel van 5 tot circa 60 minuten. Na 60 minuten neemt de absorptie geleidelijk toe door niet-specifieke kleurstofbinding aan de cuvetwand en door eiwitaggregatie. Alle monsters en standaarden moeten daarom binnen hetzelfde tijdsvenster worden gemeten — bij voorkeur precies 5 of 10 minuten na reagenstoevoeging.
Het meten van dezelfde monsterreeks met zowel Bradford als BCA geeft twee onafhankelijke concentratieschattingen. Als beide waarden goed overeenkomen, vergroot dat het vertrouwen in de meting. Bij discrepantie wijst het verschil op matrixinterferentie bij een van beide methoden. Een derde onafhankelijke meting via A280 (indien de extinctiecoëfficiënt bekend is) kan als scheidsrechter dienen. In de praktijk wordt deze drievoudige benadering toegepast bij GMP-zuiveringen en bij validatie van nieuwe protocollen.
De niet-lineariteit ontstaat doordat er een eindige hoeveelheid kleurstof in het reagens aanwezig is. Bij toenemende eiwitconcentratie wordt een steeds groter aandeel van de kleurstof gebonden, waardoor de vrije kleurstofpool uitgeput raakt en de respons afvlakt. Daarnaast versterken van der Waals-interacties en hydrofobe stapeling van kleurstofmoleculen op het eiwitoppervlak het niet-lineaire gedrag. De BCA-assay heeft dit probleem niet in dezelfde mate, omdat het koperreductieproces stoichiometrisch verloopt en het BCA-reagens in grote overmaat aanwezig is.
De Lowry-methode (Lowry et al., 1951) is de historische voorganger van de BCA-assay en berust op hetzelfde principe: koperreductie in alkalisch milieu gevolgd door een kleurreactie — bij Lowry met het Folin-Ciocalteu-reagens (fosfomolybdeen-/fosfowolfraamzuur) in plaats van BCA. De BCA-assay heeft de Lowry-methode grotendeels vervangen omdat BCA eenvoudiger uit te voeren is (minder stappen, minder tijdkritisch), een bredere buffercompatibiliteit heeft en een stabielere kleurontwikkeling geeft. De Lowry-methode wordt nog toegepast in gestandaardiseerde protocollen die naar de oorspronkelijke methode verwijzen.
De molaire extinctiecoëfficiënt bij 280 nm wordt standaard berekend op basis van de primaire structuur (aminozuurvolgorde) onder aanname van volledige denaturatie (6 M guanidinehydrochloride). In de natieve toestand kan de micro-omgeving van tryptofaan- en tyrosineresiduen de absorptie met 5–10 % verschuiven ten opzichte van de berekende waarde. Voor de meeste toepassingen is dit verschil verwaarloosbaar, maar voor absolute kwantificering — bijvoorbeeld bij de formulering van een biofarmaceutisch product — wordt de extinctiecoëfficiënt experimenteel bepaald via aminozuuranalyse of refractieve-indexmeting.
In een gereguleerd laboratorium (GMP, GLP) moet de gekozen eiwitbepalingsmethode worden gevalideerd conform de toepasselijke richtlijnen. De belangrijkste validatieparameters zijn lineariteit (bereik en correlatiecoëfficiënt van de standaardcurve), precisie (herhaalbaarheid binnen een run en reproduceerbaarheid tussen runs), juistheid (terugvinding van een bekende spike in de monstermatrix) en robuustheid (gevoeligheid voor kleine veranderingen in incubatietijd, temperatuur of reagenslotwissel).
Een bijzonder aandachtspunt is de matrixvalidatie: de validatie moet worden uitgevoerd in de daadwerkelijke monstermatrix, niet in water of een standaardbuffer. Interacties tussen matrixcomponenten en het assayreagens die niet in een waterbuffer optreden, worden anders gemist. Dit geldt met name voor de BCA-assay in lysisbuffers met complexe samenstellingen.
Eiwitkwantificering is het bepalen van de concentratie (hoeveelheid per volume-eenheid) van eiwit in een oplossing. Dit is een essentiële stap in vrijwel elk biochemisch protocol — van het normaliseren van celextracten voor gelelektroforese tot het controleren van de opbrengst na chromatografische zuivering.
De Bradford-assay meet eiwitconcentratie via binding van Coomassie Brilliant Blue G-250 (absorptie bij 595 nm, 5 min incubatie), terwijl de BCA-assay berust op koperreductie gevolgd door complexvorming met bicinchoninezuur (absorptie bij 562 nm, 30 min bij 37 °C). Bradford is sneller en verdraagt reducerende agentia, maar is gevoelig voor detergentia. BCA is uniformer over verschillende eiwitten en verdraagt detergentia, maar wordt gestoord door reducerende agentia en chelaten.
Voor het standaardprotocol is 1–25 µg eiwit in het reactievolume voldoende (bij een eindconcentratie van 100–1500 µg/mL). De micro-uitvoering werkt met 1–25 µg/mL en vereist slechts enkele microgrammen totaal. Met een microplaatlezer en 96-wellsformaat is het monstervolume 5–10 µL per well.
Ja, maar de nauwkeurigheid is beperkt. De gemeten absorptie is de som van de bijdragen van alle UV-absorberende componenten. Zonder kennis van de individuele extinctiecoëfficiënten en de samenstelling van het mengsel is de concentratie slechts bij benadering te berekenen — doorgaans met de aanname E0,1% = 1,0. Voor totaal eiwit in een mengsel zijn Bradford of BCA nauwkeuriger.
In het standaardprotocol ligt de detectielimiet bij circa 20 µg/mL. De micro-BCA-variant (langere incubatie bij 60 °C, aangepaste reagensverhouding) verlaagt de detectielimiet tot circa 0,5 µg/mL, wat vergelijkbaar is met de gevoeligste fluorimetrische methoden.
Dit is normaal en inherent aan het verschil in detectieprincipe. Bradford meet primair binding aan arginine en hydrofobe residuen, terwijl BCA primair peptidebindingen en specifieke aminozuren (Cys, Trp, Tyr) meet. Een eiwit met veel arginine maar weinig cysteïne geeft een hogere Bradford-waarde ten opzichte van BCA, en omgekeerd. Daarnaast verschilt de respons ten opzichte van de BSA-standaard. De absolute concentratie is alleen exact als het doel-eiwit zelf als standaard wordt gebruikt of als A280 met een bekende extinctiecoëfficiënt wordt toegepast.
Labvakhandel levert cuvetten (kunststof en kwarts), microtiterplaten, pipetten en pipetpunten voor eiwitkwantificering en aanverwante biochemische assays — snel leverbaar. Neem contact op voor advies over de juiste materialen voor uw protocol.
Disclaimer: De informatie in dit artikel is bedoeld als algemene technische toelichting. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl aanvaardt geen aansprakelijkheid voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische, klinische of industriële situaties. Raadpleeg voor uw eigen toepassing altijd de geldende normen, vakliteratuur en de documentatie van fabrikant en apparatuur.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
