Affiniteitschromatografie is een chromatografische scheidingstechniek waarbij een doelmolecuul — doorgaans een eiwit, antilichaam of nucleïnezuur — selectief wordt gebonden aan een stationaire fase die een complementaire ligand draagt. Het bindingsprincipe berust niet op algemene chemische eigenschappen zoals polariteit of lading, maar op een biospecifieke interactie: de bekende driedimensionale "sleutel-slot"-relatie tussen het doelmolecuul en zijn ligand. Daarmee is affiniteitschromatografie de meest selectieve chromatografische methode die beschikbaar is, en tegelijk de basisstap in vrijwel elk protocol voor de zuivering van recombinante eiwitten, monoklonale antilichamen en enzympreparaten. Affiniteitschromatografie wordt in de praktijk vrijwel altijd ingezet als capture-stap binnen een breder eiwitzuivering-protocol.
Dit artikel behandelt het werkingsprincipe, de meest gebruikte typen liganden en matrixmaterialen, de stappen van binding en elutie, de veelgestelde vragen uit de praktijk — waaronder de vragen uit de bijgesloten vragenboom — en de toepassingen in biochemisch onderzoek, de biofarmaceutische industrie en de diagnostiek. Voor de bredere context van vloeistofchromatografie zie het artikel over vloeistofchromatografie; voor andere biospecifieke analysemethoden zie ELISA en western blot.
Elke chromatografische techniek berust op een wisselwerking tussen een molecule en een stationaire fase. Bij omgekeerde-fase HPLC is dat een hydrofobe interactie; bij ionenwisselchromatografie een elektrostatische aantrekking; bij grootte-exclusiechromatografie uitsluitend een grootte-afhankelijk porietoegankelijkheid. Affiniteitschromatografie onderscheidt zich doordat de stationaire fase een specifieke ligand draagt die uitsluitend bindt aan het gewenste doelmolecuul — of aan een kleine groep structureel verwante moleculen.
De binding tussen ligand en doelmolecuul is niet-covalent en berust op een combinatie van waterstofbruggen, hydrofobe interacties, elektrostatische krachten en Van der Waals-krachten. De som van deze interacties levert een dissociatieconstante (Kd) op die typisch ligt tussen 10−4 en 10−15 mol/L. Een lage Kd — dat wil zeggen een sterke binding — geeft een hogere selectiviteit maar maakt elutie moeilijker; een hogere Kd geeft een makkelijkere elutie maar minder scherpe selectiviteit.
Het proces verloopt in vier stappen:
De basis van affiniteitschromatografie is de immobilisatie van een ligand op een dragermatrix. De ligand is het molecuul dat de specifieke binding verzorgt; de matrix is het inerte dragermateriaal dat de ligand verankert en tegelijkertijd zorgt voor voldoende vloeistofstroom door de kolom.
Eisen aan een goede affiniteitsmatrix zijn: chemisch en mechanisch stabiel, minimale aspecifieke binding van eiwitten (lage achtergrond), voldoende poreus voor grote eiwitcomplexen, en functionaliseerbaar voor ligandkoppeling. De meest gebruikte matrixmaterialen zijn:
De keuze van de ligand bepaalt de specificiteit van de affiniteitsstap. Afhankelijk van het doelmolecuul worden de volgende ligandentypen toegepast:
Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) is de meest gebruikte vorm van affiniteitschromatografie in moleculaire biologie. Het doelmolecuul is een recombinant eiwit dat tot expressie is gebracht met een polyhistidinestaart (typisch 6×His, soms 8×His of 10×His), die specifiek coördineert aan een divalent metaalion — gewoonlijk Ni2+ — dat via een chelaatvormende groep (NTA: nitrilotriazijnzuur, of IDA: iminodi-azijnzuur) aan de matrix is gebonden.
De IMAC-procedure verloopt als volgt. Binding vindt plaats bij een neutrale pH (7–8) in aanwezigheid van 300–500 mmol/L NaCl en typisch 10–20 mmol/L imidazol om aspecifieke binding van endogene histidinerijke eiwitten te reduceren. Elutie geschiedt door een gradiënt of stap naar 250–500 mmol/L imidazol, dat het His-tag competitief verplaatst van het Ni2+-ion. Alternatief wordt een stap naar pH 4,5–5 toegepast (protonering van histidine), maar dit gaat ten koste van de eiwitstabiliteit.
De voordelen van IMAC zijn de universele toepasbaarheid (elk recombinant eiwit kan een His-tag krijgen), de hoge bindingscapaciteit (10–40 mg eiwit per ml hars), het eenvoudige protocol en de geringe kosten. Een nadeel is dat de zuiverheidsgraad na één IMAC-stap zelden boven 90% uitkomt voor expressiestelsels met hoge achtergrond; een tweede chromatografische stap — typisch ionenwisseling of SEC — is dan nodig voor farmaceutische toepassingen.
Een His-tag (of histidine-tag) is een korte aminozuurreeks van doorgaans zes aaneengesloten histidine-residuen (6×His) die genetisch wordt gefuseerd aan het N- of C-uiteinde van een recombinant eiwit. De imidazoolring van histidine heeft een hoge affiniteit voor tweewaardige metaalionen, met name Ni2+. Dit maakt gerichte binding aan een IMAC-kolom mogelijk zonder dat het eiwit zelf chemisch wordt gemodificeerd. De His-tag is klein (minder dan 1 kDa), interfereert in de meeste gevallen niet met de eiwitfunctie en kan zo nodig na de zuivering enzymatisch worden verwijderd met een protease (TEV of thrombine) via een specifieke kloofsequentie. Alternatieven voor de His-tag zijn de GST-tag (glutathion-S-transferase, circa 26 kDa, biedt tevens verhoogde oplosbaarheid) en de Strep-tag (korte peptidereeks die bindt aan Strep-Tactin, een gemodificeerd streptavidine), elk met hun eigen afweging tussen bindingssterkte, verwijderbaarheid en invloed op eiwiteigenschappen.
De zuivering van monoklonale antilichamen is de grootste industriële toepassing van affiniteitschromatografie. Proteïne A (afkomstig van Staphylococcus aureus) en Proteïne G (afkomstig van Streptococcen) binden met hoge affiniteit en specificiteit aan de Fc-regio van IgG-antilichamen. Afhankelijk van de antilichaamsubklasse en de diersoort wordt Proteïne A (voorkeur voor menselijk IgG1, IgG2, IgG4 en muizen IgG2a, IgG2b, IgG3) of Proteïne G (bredere selectiviteit, inclusief IgG3 en IgG van meer species) gekozen.
De industriële Proteïne A-kolom is de primaire capture-stap in de productie van biofarmaceutische antilichamen. Na binding in fysiologische buffer (PBS, pH 7,4) wordt het antilichaam geëlueerd bij pH 3–3,5 met glycine-buffer. Dit lage pH-stap is effectief maar vereist onmiddellijke neutralisatie om aggregatie te voorkomen. De Proteïne A-hars heeft een capaciteit van 30–50 mg antilichaam per ml hars en kan 100–200 cycli mee bij goed gebruik.
Voor de analytische karakterisering van antilichamen in onderzoeksopstellingen is Proteïne A/G-chromatografie ook toepasbaar op HPLC-schaal (Protein A HPLC), wat snelle titratie van antilichaamconcentraties in celkweekvloeistoffen mogelijk maakt. Zie ook het kennisbankartikel over celkweektechnieken voor de upstream context van antilichaamproductie.
De levensduur van een affiniteitskolom hangt af van het ligandtype, de mate van sanitatie en het gebruik. Proteïne A-harsen voor industrieel gebruik zijn ontworpen voor 100–200 productiecycli mits ze na elke cyclus worden gesaniteerd met 0,1–0,5 mol/L NaOH. IMAC-kolommen (Ni-NTA of Ni-IDA) verliezen na verloop van tijd bindingscapaciteit door lekkage van het metaalion; ze worden geregenereerd door stripping met EDTA gevolgd door re-lading met NiSO4. Agarose-gebaseerde matrices voor laboratoriumgebruik zijn doorgaans goed voor tientallen cycli bij correct gebruik. Degradatie wordt versneld door sterke reductantia (DTT, β-mercaptoethanol), hoge concentraties organische solventen, te agressieve sanitatieprotocollen en onjuiste opslag. Opslag in 20% ethanol bij 4 °C verlengt de levensduur van de meeste eiwitaffiniteitsharsen aanzienlijk.
Elutie is de stap waarbij het gebonden doelmolecuul selectief van de ligand wordt losgemaakt en de kolom verlaat. Omdat de binding bij affiniteitschromatografie biospecifiek en vaak relatief sterk is, is een gerichte verandering in de omstandigheden nodig om de binding te verbreken. De meest toegepaste elutiemethoden zijn:
De keuze van elutiemethode heeft directe consequenties voor de integriteit van het gezuiverde eiwit. Een pH van 3 is effectief voor antilichamen maar kan labiele eiwitten denatureren. Competitieve elutie met imidazol is mild maar vereist nadien ontzilting of dialyse. De elutieomstandigheden worden daarom altijd afgestemd op de stabiliteit van het doeleiwit.
Affiniteitschromatografie kent in de literatuur en de industrie meerdere synoniemen en verwante termen, afhankelijk van het gebruikte ligandtype of de specifieke toepassing:
De term "affiniteit" in affiniteitschromatografie verwijst naar de chemische verwantschap tussen twee moleculen — de neiging van twee moleculen om zich aan elkaar te binden. In de biochemie wordt deze affiniteit uitgedrukt in de dissociatieconstante Kd: de concentratie van het ligand waarbij 50% van de bindingsplaatsen bezet zijn. Een lage Kd-waarde (bijvoorbeeld 10−9 mol/L, ofwel 1 nmol/L) betekent een hoge affiniteit en een sterke binding; een hoge Kd (10−4 mol/L) betekent een zwakkere, vluchtigere interactie.
In de praktijk van affiniteitschromatografie zijn ligandsystemen met een Kd tussen 10−6 en 10−9 mol/L ideaal: de binding is sterk genoeg voor selectieve retentie en reproduceerbaar wassen, maar zwak genoeg voor milde elutie zonder het eiwit te denatureren. Systemen met een Kd lager dan 10−12 mol/L (zoals streptavidine–biotine, Kd ≈ 10−15 mol/L) zijn zo sterk dat elutie van intact eiwit praktisch onmogelijk is; zulke systemen worden gebruikt voor onherstelbare capture, niet voor purificatie.
Zowel streptavidine (afkomstig van Streptomyces avidinii) als avidine (een glycoproteïne uit kippenei-eiwit) binden biotine met een uitzonderlijk lage Kd van circa 10−15 mol/L — de sterkste niet-covalente binding die in de natuur voorkomt. In de praktijk heeft streptavidine de voorkeur boven avidine voor laboratoriumtoepassingen: het is niet geglycosyleerd (minder aspecifieke binding aan lectine-receptoren), heeft een neutraal isoelektrisch punt (minder elektrostatische bijbinding) en is stabieler over een breed pH- en temperatuurtraject. De extreem sterke streptavidine–biotine-interactie maakt echte elutie van intact eiwit onpraktisch; in plaats daarvan worden streptavidine-gecoate matrices ingezet voor capture en vervolgens worden de biotinyleerde moleculen samen met de matrix geanalyseerd of enzymatisch losgemaakt. Voor toepassingen waarbij elutie wel vereist is, worden gemodificeerde varianten zoals monomeer streptavidine (verlaagde Kd tot circa 10−7 mol/L) of de Strep-Tactin/Strep-tag-combinatie gebruikt.
Affiniteitschromatografie wordt zelden als enige stap ingezet; het maakt deel uit van een meertraps purificatieprotocol. De typische volgorde voor de purificatie van een recombinant eiwit is: clarificatie (centrifugatie of filtratie) → affiniteitsstap (capture, 10- tot 1000-voudig opconcentreren en aanrijken) → intermediaire chromatografie (ionenwisseling of hydrofobe interactie, verwijdering van restverontreinigingen) → polijststap (SEC of RP-HPLC, verwijdering van aggregaten en dimeren).
Vergeleken met de andere vijf basismechanismen van chromatografie (adsorptie, partitie, ionenwisseling, grootte-exclusie, en hydrofobe interactie) biedt affiniteitschromatografie de hoogste selectiviteit maar ook de hoogste kosten per cyclus. De kosten worden bepaald door de prijs van de ligand (Proteïne A-hars kost 2.000–5.000 euro per liter), de beperkte levensduur en de noodzaak van strikte regeneratie- en sanitatieprotocollen in farmaceutische productie.
Zie voor de andere chromatografische methoden de artikelen over omgekeerde-fase HPLC, ionenwisselchromatografie en grootte-exclusiechromatografie (SEC/GPC).
HPLC (High Performance Liquid Chromatography) is een overkoepelende techniek die verwijst naar de manier waarop een chromatografische scheiding wordt uitgevoerd — namelijk onder hoge druk met kleine, uniforme deeltjes voor een snelle doorstroming — en niet naar het scheidingsprincipe zelf. Affiniteitschromatografie beschrijft juist wél het scheidingsprincipe: selectieve biospecifieke binding. De twee zijn daarmee niet elkaars tegenpolen maar aanvullend: affiniteitschromatografie kan worden uitgevoerd op HPLC-schaal (hogere druk, snellere doorlooptijd, analytische kolomformaten) of op FPLC-schaal (lagere druk, preparatieve hoeveelheden). Omgekeerde-fase HPLC, ionenwisselchromatografie en grootte-exclusiechromatografie maken evenmin gebruik van biospecifieke herkenning; zij scheiden op hydrofobiciteit, lading respectievelijk grootte. Het praktische onderscheid voor de laborant: bij HPLC-methoden is de methode breed toepasbaar voor veel verbindingen; een affiniteitskolom is bewust ontworpen voor één specifiek doelmolecuul of een nauw verwante klasse.
In het wetenschappelijk laboratorium is affiniteitschromatografie de standaardmethode voor de isolatie van recombinante eiwitten uit bacteriële (E. coli), gist- of zoogdiercelsystemen. Een His-tag of GST-tag wordt genetisch toegevoegd aan het eiwit van interesse; na cellysis biedt IMAC of glutathion-Sepharose een snelle, reproduceerbare purificatie in één stap. De zuiverheid na één IMAC-stap bedraagt typisch 70–95%, afhankelijk van de expressieniveaus en de cellulaire achtergrond.
De methode is onmisbaar als startpunt voor verdere karakterisering: enzymatische activiteitsstudies, interactieanalyse via isothermische titratiecalorimetrie (ITC), kristallisatie voor röntgendiffractie, of functionele assays. Zonder een reagens van adequate zuiverheid zijn dergelijke studies oninterpreteerbaar.
De productie van monoklonale antilichamen (mAbs) als geneesmiddel — van trastuzumab bij borstkanker tot adalimumab bij reumatoïde artritis — verloopt in drie opeenvolgende chromatografische stappen. De eerste stap is altijd een Proteïne A-stap die het antilichaam selectief vasthoudt terwijl celcultuurdebris, nucleïnezuren, gastheerceleiwitten en groeifactoren worden doorgespoed. Na deze capture-stap is de zuiverheid doorgaans > 99% voor IgG, en het product is in volume 100- tot 1000-voudig geconcentreerd. De twee vervolgstappen (ionenwisseling en SEC) verwijderen de resterende verontreinigingen en aggregaten tot onder de farmacopee-grens.
In de klinische laboratoriumdiagnostiek wordt immunoaffiniteitschromatografie ingezet voor de isolatie van specifieke analytes uit serummonsters vóór de eigenlijke detectie. Voorbeelden zijn de zuivering van vitamine D-metabolieten, steroïdhormonen en therapeutische geneesmiddelspiegels. De zuivering verhoogt de specificiteit van de navolgende massaspectrometrische of immunochemische meting, zoals beschreven in het artikel over massaspectrometrie.
In proteomics worden immunoaffiniteitskolommen gebruikt voor de verwijdering van albumine, IgG en andere dominante serumeiwitten, zodat laag-abundante biomarkers beter in beeld komen. Zie het artikel over proteomics en 2D-PAGE voor een uitgebreidere bespreking van deze depletiestrategie.
Affiniteitsmatrialen worden ook ingezet voor de isolatie van specifieke RNA-moleculen en DNA-fragmenten. Poly-T-kolommen (oligo-dT-cellulose) binden selectief mRNA via de poly-A-staart, terwijl rRNA en tRNA doorlopen — dit is de standaard voor mRNA-zuivering ten behoeve van cDNA-synthese en next-generation sequencing. Streptavidine-gecoate magnetische beads worden gebruikt voor de capture van biotinyleerde DNA- of RNA-probes met hun hybridisatieproducten. Zie voor de bredere context van RNA-zuivering en -isolatiemethoden het artikel over RNA-isolatie en RNA-analyse.
Voor reproduceerbare affiniteitschromatografie zijn enkele praktische punten van belang. De monstervoorbereiding is kritisch: cellysis-buffers moeten worden afgestemd op de bindingscondities van de kolom (pH, NaCl-concentratie, reductiemiddelen). DTT en β-mercaptoethanol interfereren met Ni2+-IMAC-kolommen doordat thiolgroepen het metaalion cheleren; gebruik dan TCEP als reductant. EDTA verwijdert het metaalion uit IMAC-hars en mag nooit worden gebruikt in de bindingsbuffer.
De kolom-regeneratie bepaalt in hoge mate de levensduur en reproduceerbaarheid. Proteïne A-kolommen worden na elke cyclus gesaniteerd met 0,1–0,5 mol/L NaOH om virale en bacteriële contaminanten te inactiveren; de hars tolereert dit mits de NaOH-concentratie en -tijd worden bewaakt. IMAC-kolommen worden geregenereerd door stripping van het metaalion met EDTA, gevolgd door re-laad met verse NiSO4. Het eluaat kan na afloop worden behandeld via membraanscheidingstechnieken zoals ultrafiltratie of dialyse om het eluens te verwijderen en het eiwit op te concentreren.
Voor de juiste buffers, pH-metres, filtreermaterialen en verbruiksartikelen voor uw zuiveringsprotocol, zie de categorieën glaswerk en porselein en laboratoriumplastics.
Affiniteitschromatografie werkt door een doelmolecuul selectief te binden aan een ligand die covalent gebonden is aan een matrixdrager in de kolom. Het doelmolecuul heeft een hoge biologische affiniteit voor dat ligand — vergelijkbaar met een enzym en zijn substraat, of een antilichaam en zijn antigeen. Alle andere moleculen in het monster passeren de kolom zonder te binden. Na het wassen van ongebonden verontreinigingen wordt de binding gericht verbroken (door pH-verandering, competitief eluens of hoge zoutconcentratie) en verlaat het doelmolecuul de kolom in gezuiverde vorm.
Elueren is het proces waarbij een gebonden molecule van de stationaire fase wordt losgemaakt en de kolom verlaat samen met de mobiele fase. Elutie is de stap of het resultaat van dat proces: het vrijmaken van het gebonden doelmolecuul van de ligand. Doordat de binding bij affiniteitschromatografie biospecifiek en vaak sterk is, volstaat eenvoudig spoelen met buffer niet. In de praktijk wordt de binding verbroken door een gerichte verandering: een verlaging van de pH (bijv. glycine pH 3 voor Proteïne A-kolommen), een competitief eluens (bijv. imidazol voor IMAC), een verhoging van de zoutconcentratie of, als laatste optie, denaturerende omstandigheden. De keuze van de elutiemethode wordt bepaald door de stabiliteit van het te zuiveren eiwit en de sterkte van de ligand-doelmolecuulinteractie.
Adsorptie en elutie zijn de twee tegenovergestelde stappen in een chromatografisch proces. Adsorptie is de binding van een molecule aan de stationaire fase — in het geval van affiniteitschromatografie de biospecifieke interactie van het doelmolecuul met de ligand op de matrix. Elutie is het omgekeerde: de gerichte ontkoppeling en het meevoeren van dat molecule door de mobiele fase. Tussen adsorptie en elutie bevindt zich de wasstap, waarbij ongebonden en zwak gebonden verontreinigingen worden verwijderd terwijl het doelmolecuul geadsorbeerd blijft. Het samenspel van selectieve adsorptie en gerichte elutie is de kern van wat affiniteitschromatografie zo zuiver maakt.
Afhankelijk van het ligandtype en de toepassing zijn gangbare synoniemen: biospecifieke adsorptie (historische Nederlandse term), IMAC (voor His-getagde eiwitten via metaalchelaat), Proteïne A-chromatografie (voor antilichamen), immunoaffiniteitschromatografie (voor antilichaampaar liganden), GST-pull-down (voor GST-fusie-eiwitten) en covalente chromatografie (bij tijdelijk covalente binding). In proteomics wordt de term immunodepletie gebruikt voor het omgekeerde doel: het wegvangen van storende eiwitten in plaats van het doeleiwit.
Affiniteit verwijst naar de neiging van twee moleculen om een stabiel niet-covalent complex te vormen. In chromatografische context geeft de dissociatieconstante Kd aan hoe sterk die binding is: hoe lager de Kd, hoe sterker de affiniteit. Bij affiniteitschromatografie wordt bewust gezocht naar een ligand met een Kd van 10−6 tot 10−9 mol/L, zodat selectieve binding en milde elutie combineerbaar zijn. Systemen met een te lage Kd (zoals streptavidine-biotine) zijn zo sterk dat elutie van intact eiwit niet meer mogelijk is.
Ionenwisselchromatografie scheidt moleculen op basis van hun nettolading en interactie met een tegengesteld geladen stationaire fase; het is een aspecifieke techniek die alle eiwitten met de juiste lading retineert. Affiniteitschromatografie is biospecifiek: alleen het molecuul met de juiste driedimensionale herkenning voor het ligand bindt. Dit geeft affiniteitschromatografie een veel hogere selectiviteit maar ook een engere toepasbaarheid: de kolom is ontworpen voor één doelmolecuul of een nauw verwante groep.
Ja, maar minder gebruikelijk dan voor eiwitten. Kleine moleculen kunnen worden gezuiverd via immunoaffiniteitschromatografie als er antilichamen tegen beschikbaar zijn (bijv. voor mycotoxines, pesticides, steroïdhormonen in milieuanalyse). Voor de zuivering van recombinante kleine peptiden of moleculen waarvoor geen antilichaam beschikbaar is, zijn omgekeerde-fase HPLC of ionenwisseling doorgaans praktischer.
Ja, en deze combinatie is in de eiwitanalytiek wijdverbreid. In de meest toegepaste opzet wordt het gezuiverde eiwit na affiniteitschromatografie enzymatisch (bijv. met trypsine) gefragmenteerd en de resulterende peptiden worden geanalyseerd via LC-MS/MS. Bij immunoaffiniteitschromatografie voor biomarkeranalyse worden specifieke eiwitten of peptiden eerst selectief gecaptured met een antilichaamkolom en vervolgens losgemaakt en overgebracht naar de massaspectrometer; dit vergroot zowel de gevoeligheid als de specificiteit van de meting aanzienlijk ten opzichte van directe massaspectrometrie op ruwe serummonsters. Zie het artikel over gelelectroforese voor aanvullende scheidingsstappen die vooraf aan de massaspectrometrische analyse kunnen worden ingezet.
In de praktijk treden bij affiniteitschromatografie een aantal terugkerende problemen op. Aspecifieke binding is de meest voorkomende oorzaak van onzuivere elutiepieken: eiwitten met oppervlaktehistidine of positieve lading binden niet-specifiek aan IMAC-hars; dit wordt beperkt door 10–20 mmol/L imidazol aan de bindingsbuffer toe te voegen en door de ionensterkte te verhogen (300–500 mmol/L NaCl). Ligandlekkage treedt op bij Proteïne A-kolommen na intensief gebruik of te agressieve sanitatie, wat leidt tot verontreiniging van het eindproduct met ligandsporen; reguliere kolominspectie en het beperken van NaOH-concentratie en -contacttijd reduceren dit risico. Verlies van bindingscapaciteit bij IMAC-kolommen wordt veroorzaakt door lekkage van het metaalion, met name wanneer EDTA of thiogroepen aanwezig zijn in de monstermatrix; preventie bestaat uit het vermijden van EDTA en DTT in bindingsbuffers en periodieke re-lading van het metaalion. Onvolledige elutie, waarbij een deel van het doeleiwit op de kolom achterblijft, wijst doorgaans op een te sterke ligand-doelmolecuulinteractie of een te snelle doorstroming tijdens de elutiestap; verlenging van de incubatietijd of een stapsgewijze gradiënt lost dit meestal op. Tot slot kan eiwitprecipitatie optreden direct na elutie, vooral bij lage pH (Proteïne A elutie, pH 3–3,5): snelle neutralisatie met 1 mol/L Tris (pH 9) en directe opname in een eiwitstabiliserend buffer voorkomen aggregatie.
Ondanks de hoge selectiviteit kent affiniteitschromatografie een aantal beperkingen. De kosten per cyclus zijn aanzienlijk hoger dan bij ionenwisseling of grootte-exclusiechromatografie: Proteïne A-harsen kosten 2.000–5.000 euro per liter, en de bindingscapaciteit neemt met gebruik af. De methode is van nature mono-specifiek: één kolom is ontworpen voor één doelmolecuul of een nauw verwante groep moleculen; voor elke nieuwe doelstelling is een nieuwe kolom met bijpassende ligand nodig. Liganddegradatie door herhaalde sanitatie of blootstelling aan extreme pH beperkt de levensduur. Aspecifieke binding van storende eiwitten, hoewel gering, is nooit volledig uit te sluiten, wat extra polijststappen noodzakelijk maakt voor farmaceutische toepassingen. Affiniteitschromatografie is evenals alle vloeistofchromatografische methoden niet-destructief voor het doelmolecuul mits de elutieomstandigheden mild zijn: het eiwit verlaat de kolom in oplossing en behoudt zijn biologische activiteit. Destructie kan echter optreden bij denaturerende elutiestappen (urea, guanidine) of bij langdurige blootstelling aan lage pH. Voor monsters met een zeer lage concentratie doelmolecuul kan de bindingstijd en de grote hoeveelheid benodigde matrixvolume een praktische belemmering vormen.
Nee. Dunnelaagchromatografie (TLC) en affiniteitschromatografie zijn beide chromatografische technieken, maar ze berusten op een fundamenteel ander scheidingsprincipe. TLC scheidt moleculen op basis van hun relatieve affiniteit voor een polaire stationaire fase (silicagelplaat) en een minder polaire mobiele fase (oplosmiddel) — een aspecifieke partitie- of adsorptie-interactie. Affiniteitschromatografie berust op een biospecifieke, molecuul-herkenning: het doelmolecuul bindt uitsluitend aan zijn complementaire ligand. TLC wordt voornamelijk ingezet voor kleine organische moleculen, pigmenten en lipiden; affiniteitschromatografie is de standaardtechniek voor de zuivering van eiwitten en nucleïnezuren. De twee technieken worden niet gecombineerd of verwisseld in de professionele laboratoriumsetting. Zie voor een overzicht van de rol van TLC binnen het bredere chromatografielandschap het artikel over dunnelaagchromatografie.
Een eenvoudige affiniteitsopstelling bestaat uit een spuitkolom of zwaartekrachtkolom gevuld met affiniteitshars, een peristaltische pomp of FPLC-systeem, en een UV-monitor bij 280 nm voor detectie van eiwitpieken. Voor HPLC-schaal is een standaard HPLC-systeem met drukbestendige affiniteitskolom voldoende. Vereiste verbruiksartikelen zijn: filtreermembranen (0,2 µm) voor clarificatie van lysaten, zuigfilters of spuitfilters voor buffers, pH-buffers en pH-meter voor elutie-optimalisatie, en dialysemembranen of eiwitconcentratoren voor het nabehandelen van het eluaat. Bekijk het assortiment chromatografiematerialen of neem contact op voor advies over de juiste opstelling voor uw purificatiedoelstelling.
Disclaimer: De informatie in dit artikel is bedoeld als algemene technische toelichting. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl aanvaardt geen aansprakelijkheid voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische, klinische of industriële situaties. Raadpleeg voor uw eigen toepassing altijd de geldende normen, vakliteratuur en de documentatie van fabrikant en apparatuur.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
