Aseptische techniek is het geheel van handelingen waarmee wordt voorkomen dat micro-organismen een steriel product, monster, kweek of systeem bereiken. Waar steriliteit een eigenschap is van een materiaal of oppervlak, is aseptisch werken een werkwijze: het is de discipline waarmee de steriliteitsstatus tijdens uitvoering behouden blijft. In microbiologie, celkweek, farmaceutische bereiding en klinische diagnostiek is aseptische techniek de basis voor betrouwbare resultaten en veilige eindproducten. Dit artikel behandelt de principes, de standaardhandelingen, de benodigde materialen en de meest voorkomende foutbronnen, aangevuld met een schema van de werkflow en veelgestelde vragen.
Aseptische techniek is een gestandaardiseerde werkwijze die de overdracht van micro-organismen naar een steriele omgeving, monster of cultuur voorkomt. De methode combineert vier elementen: gesteriliseerde materialen, een gecontroleerde werkomgeving, een gedisciplineerde uitvoerder en een validatiestap achteraf. De techniek wordt toegepast telkens wanneer contaminatie het resultaat, het product of de patiënt in gevaar zou brengen — van het uitplaten van een agarplaat tot het bereiden van een parenteraal geneesmiddel.
Aseptisch werken staat niet los van de omgeving. In een gewone laboratoriumruimte volstaan een bunsenbrander en een schone werkbank. Bij celkweek of farmaceutische bereiding is een laminaire flow-kast of biologische veiligheidskast klasse II vereist, met bijbehorende omgevingsbeheersing conform ISO 14644 en EU GMP Annex 1.
De twee begrippen worden vaak door elkaar gebruikt maar hebben een verschillende betekenis. Steriel is een toestand: het product bevat geen levensvatbare micro-organismen (SAL ≤ 10⁻⁶). Aseptisch is een werkwijze: het geheel van handelingen dat voorkomt dat een steriel product besmet raakt. Een steriel pipetpuntje verliest zijn steriliteitsstatus zodra het aseptisch niet correct wordt gehanteerd. Omgekeerd garandeert aseptisch werken alleen resultaat als de gebruikte materialen daadwerkelijk steriel zijn.
De werkplek wordt gedesinfecteerd met 70% ethanol of 70% isopropanol. De hogere waterfractie (30%) is essentieel: puur alcohol verdampt te snel om celwanden te penetreren. Alle materialen worden gecontroleerd op steriliteitsindicator, houdbaarheidsdatum en verpakkingsintegriteit. Autoclaveerbare materialen — glaswerk, PP-buizen, roestvaststalen instrumenten — worden vooraf gesteriliseerd in een autoclaaf bij 121 °C gedurende 15 minuten. Hittelabiele oplossingen worden steriel gefiltreerd via een 0,22 µm membraanfilter.
De kritische zone is de fysieke ruimte waar het steriele product of monster wordt blootgesteld aan de omgeving. Rond een bunsenbrander ontstaat door de opstijgende warme luchtstroom een lokaal kiemvrije zone van circa 20 cm. In een LAF-kast wordt via HEPA-gefilterde lucht een deeltjesvrije werkzone gecreeerd. In beide gevallen geldt: hoe kleiner en korter de blootstelling van de kritische zone, hoe kleiner het besmettingsrisico.
De handelingen worden vloeiend en met minimaal materiaalcontact uitgevoerd. Belangrijke regels: entogen (osen) worden voor en na gebruik door de vlam gehaald tot roodgloeiend; flesopeningen worden na het openen en voor het sluiten kort door de vlam gehaald; deksels worden op de rand van de werkbank gelegd (nooit met de opening naar boven); handen worden nooit boven open flessen of platen gehouden. Werk altijd van schoon naar vuil en van de meest kwetsbare naar de minst kwetsbare stap.
Aseptisch werken is pas compleet als het resultaat aantoonbaar is. Bij microbiologische kweek geldt een negatieve controle (niet-geinoculeerde plaat) als bewijs dat het medium en de techniek kiemvrij zijn. Bij farmaceutische aseptische bereiding worden settle plates (open geplaatste agarplaten) en contactplaten gebruikt om luchtkwaliteit en oppervlakcontaminatie in de kritische zone continu te bewaken. Alle uitgevoerde stappen worden vastgelegd in een elektronisch labjournal of LIMS.
De entoog (oosje) wordt schuin in de vlam gehouden, van het handvat naar de lus toe, tot de gehele draad roodgloeiend is. Laat de oos daarna kort afkoelen (5–10 seconden) boven de vlam — te heet doodt de over te dragen cellen; te koud biedt geen zekerheid over steriliteit. Voor grote hoeveelheden entlingen zijn infrarood-entoog-sterilisatoren een alternatief zonder open vuur.
Pipetteerhandelingen in aseptische context vereisen steriele, individueel verpakte of geautoclaveerde pipetpuntjes met filter. De verpakking wordt pas geopend in de kritische zone. Zet de pipet neer met de tip naar boven; leg deze nooit horizontaal op de werkbank waar de tip vloeistof kan opzuigen. Wissel de tip bij elk nieuw monster of medium om kruisbesmetting te voorkomen.
Verwijder de dop met de pink en de muis van dezelfde hand die ook de fles vasthoudt; houd de dop tussen deze vingers vast en raak de binnenkant nooit aan. Vlam de flesopening kort, giet of pipetteer over, vlam nogmaals en plaats de dop direct terug. Deze techniek beperkt de blootstellingstijd tot enkele seconden.
Op een agarplaat wordt de druppel monster met een steriele Drigalski-spatel of een gebogen glazen staafje verdeeld. Bij de streepplaat-methode wordt de entoog in vier of vijf sectoren over de plaat gestreken, tussen elke sector wordt de oos opnieuw vlamgesteriliseerd. Deze techniek verdunt de kolonies zodanig dat na incubatie individuele kolonies zichtbaar worden.
Een LAF-kast levert HEPA-gefilterde lucht (ISO klasse 5, oftewel EU GMP graad A) direct over het werkoppervlak. De luchtsnelheid ligt typisch tussen 0,36 en 0,54 m/s. Belangrijke werkregels:
Voor werk met pathogenen of gemodificeerde organismen is een biologische veiligheidskast klasse II vereist — deze combineert operatorbescherming, productbescherming en omgevingsbescherming. Zie voor de keuze van kasttype en toepassing het artikel over zuurkasten en werkkasten. Voor werken met risicogroepen 1 tot 4 is aanvullend het bijbehorende BSL-veiligheidsniveau van toepassing.
Aseptisch werken is in meerdere internationale normen en richtlijnen verankerd. De belangrijkste referenties zijn:
De geactualiseerde versie van EU GMP Annex 1 (van kracht sinds 25 augustus 2023) introduceert het begrip Contamination Control Strategy (CCS): een geintegreerd document waarin alle maatregelen ter voorkoming van microbiele, deeltjes- en endotoxine-contaminatie zijn vastgelegd. Zie voor de geldende Europese richtsnoeren de EudraLex Volume 4 — EU GMP-richtsnoeren van de Europese Commissie.
In een microbiologisch laboratorium is aseptische techniek de norm bij het bereiden van voedingsbodems, het enten van kweken, het overzetten van stammen en het uitvoeren van kolonietellingen. De streepplaatmethode, de verdunningsreeks en de kolonieoverzetting zijn allen alleen betrouwbaar bij consequent aseptisch werken.
Bij het passeren van cellijnen, het opzetten van nieuwe kweken en het ontdooien van vials is aseptisch werken onder een klasse II-veiligheidskast verplicht. De grootste risico's in celkweek zijn mycoplasmacontaminatie (onzichtbaar zonder specifieke assay) en kruisbesmetting tussen cellijnen. Aseptisch werken wordt aangevuld met authenticatie via STR-profilering en periodieke mycoplasma-tests. Zie voor de bijbehorende technieken het artikel over celkweektechnieken.
Aseptische bereiding is verplicht bij de productie van parenteralia, oogdruppels, infuusvloeistoffen en radiofarmaca die niet terminaal gesteriliseerd kunnen worden. De uitvoering geschiedt in een graad A-omgeving (isolator of LAF) binnen een graad B-cleanroom. Elke bereiding wordt gevolgd door een steriliteitstest volgens Ph. Eur. 2.6.1 en een media fill-simulatie om de aseptische handelingen periodiek te valideren.
Bloedkweken, punctaten en biopten worden onder aseptische condities afgenomen om vals-positieve resultaten uit te sluiten. Bij microbiologische diagnostiek is de scheiding tussen commensale flora en pathogenen alleen mogelijk als de monstername kiemvrij verloopt. Voor toepassing in medische laboratoria zie ook het artikel over ISO 15189-accreditatie.
Bij Legionella-analyse, kiemgetalbepaling en indicatororganismen (E. coli, coliformen) is aseptisch werken essentieel om externe contaminatie van het analyseresultaat te voorkomen. Filterhouders, membraanfilters en pincetten worden autoclaafgesteriliseerd of geleverd als steriele wegwerpartikelen.
Op mbo-, hbo- en universitair niveau wordt aseptisch werken al vroeg aangeleerd omdat het de basis vormt voor vrijwel alle microbiologische en biotechnologische practica. Standaard leeropdrachten zijn de streepplaat, de gietplaatmethode, het maken van een verdunningsreeks en het bereiden van een agarplaat. Basale uitrusting: een bunsen- of teclubrander, entogen, steriele petrischalen, een kleine autoclaaf en handschoenen. Zie ook het overzicht laboratoriumapparatuur voor scholen.
Steriel is een product-eigenschap: vrij van alle levensvatbare micro-organismen (SAL ≤ 10⁻⁶). Aseptisch is een werkwijze om deze steriliteit te behouden tijdens het gebruik. Desinfecteren is het reduceren van het aantal micro-organismen tot een veilig niveau, zonder dat alle sporen worden gedood. In de praktijk zijn de drie complementair: een gedesinfecteerd oppervlak, steriel materiaal en een aseptische werkwijze zijn samen nodig voor een kiemvrij resultaat.
Puur ethanol verdampt vrijwel direct van een oppervlak en heeft daardoor onvoldoende inwerkingstijd. De aanwezigheid van 30% water zorgt bovendien dat de alcohol de eiwitten en celwanden van micro-organismen kan penetreren en denatureren. Concentraties tussen 60 en 80% hebben de hoogste bactericide werking; boven 90% daalt de effectiviteit sterk. Isopropanol (70%) heeft een vergelijkbare werking en wordt in de farmaceutische praktijk vaak verkozen omdat het minder snel verdampt.
Nee. Open vuur verstoort de laminaire luchtstroming, kan de HEPA-filter beschadigen en creeert een brandrisico in een besloten ruimte met alcoholdampen. In een LAF- of veiligheidskast wordt aseptisch enten gedaan met steriele wegwerp-oosjes of een infrarood-entoog-sterilisator. Een klassieke bunsenbrander hoort thuis op een open werkbank in een microbiologisch practicumlokaal, niet in een cleanroom of celkweekruimte.
Zodra een steriele verpakking is geopend, is de steriliteitsstatus in principe direct aan degradatie onderhevig. In een LAF- of veiligheidskast met correcte techniek kan een fles gedurende een sessie (typisch enkele uren) worden gebruikt, mits deze tussentijds gesloten wordt. Buiten een gecontroleerde zone is single-use het veilige uitgangspunt. Voor herhaald gebruik ontworpen flessen (bijv. steriel water of PBS) hebben een fabrieksspecifieke gebruikstermijn na eerste opening; volg altijd de bijsluiter.
Een media fill (ook procesvalidatie-simulatie) is een test waarbij de aseptische bereiding wordt uitgevoerd met een steriel groeimedium in plaats van het werkelijke product. Na incubatie wordt beoordeeld of het medium troebel wordt (bewijs van besmetting) of helder blijft. De test valideert de gecombineerde bijdrage van omgeving, materialen en operator. In de farmaceutische praktijk wordt de media fill periodiek herhaald, minimaal jaarlijks per shift en per operator, conform EU GMP Annex 1.
De negatieve controle is een niet-geinoculeerde plaat of buis die dezelfde behandeling ondergaat als de monsters. Blijft deze na incubatie steriel, dan is bewezen dat het medium, het materiaal en de aseptische techniek in orde waren. Groei op de negatieve controle betekent dat het resultaat op de monsters niet aan de kweek kan worden toegeschreven maar mogelijk aan contaminatie. Zonder negatieve controle is een microbiologische kweek niet valideerbaar.
Een settle plate is een open agarplaat die gedurende een gedefinieerde tijd (typisch vier uur) in de kritische zone wordt geplaatst om neerdwarrelende deeltjes en micro-organismen af te vangen. Na incubatie wordt het aantal kolonies geteld als maat voor de luchtkwaliteit. EU GMP Annex 1 stelt grenswaarden per graad: < 1 kve per 4 uur voor graad A, < 5 kve per 4 uur voor graad B, < 50 kve per 4 uur voor graad C en < 100 kve per 4 uur voor graad D.
Voor eenvoudige microbiologische handelingen zoals het uitplaten van een agarplaat, het overenten van bacteriekweken of het bereiden van niet-steriele voedingsbodems is een open werkbank met een bunsen- of teclubrander toereikend, mits de omgeving stofarm is en de deuren gesloten zijn. Voor celkweek, primaire cellen, virale kweken, aseptische farmaceutische bereiding en werk met risicogroep 2 of hoger is een LAF-kast of biologische veiligheidskast verplicht. De keuze hangt af van het besmettingsrisico voor het product en van het risico voor de uitvoerder.
De Contamination Control Strategy is het gestandaardiseerde document waarin, sinds de herziening van EU GMP Annex 1 (2022), alle maatregelen worden vastgelegd die bijdragen aan de beheersing van microbiele, deeltjes- en endotoxine-contaminatie in een steriele productieomgeving. De CCS beschrijft procesontwerp, cleanroom-classificatie, personeelsbeheer, materiaal- en luchtstromen, sterilisatie, aseptische techniek, bewaking en trending. De CCS is voor GMP-audits een centraal auditobject.
Broth transfer is het overbrengen van een klein volume vloeibare kweek (bouillon) naar vers medium om de kweek in een groeifase te houden of te expanderen. De handeling gebeurt aseptisch: flesopeningen worden gevlamd, een steriele pipet wordt gebruikt en de overdracht vindt plaats binnen de kritische zone. Subcultuur is een verwant begrip: het overzetten van een deel van een kweek naar een verse plaat of medium, gebruikt om cellijnen te passeren of om isolaten uit een mengcultuur te zuiveren.
Filterpipetpunten hebben een hydrofobe membraanbarriere in de tip die voorkomt dat vloeistof of aerosolen in het pipetlichaam terechtkomen. Dit heeft twee gevolgen: de pipet raakt niet besmet met het monster (kruisbesmetting tussen monsters wordt uitgesloten) en de gebruiker wordt beschermd tegen aerosolen van pathogenen. In moleculair werk voorkomen filterpipetpunten ook DNase/RNase-contaminatie van de pipet.
In een niet-GMP-context is het gebruik van gedesinfecteerde handschoenen sterk aanbevolen maar niet strikt verplicht — op voorwaarde dat de handen grondig worden gewassen en met 70% ethanol gedesinfecteerd tussen elke handeling. In een GMP-omgeving, celkweek en klinische bereiding zijn steriele handschoenen verplicht en worden ze periodiek tijdens de sessie herdesinfecteerd. In alle gevallen geldt: gladde synthetische handschoenen (nitril) genereren minder aerosolen dan latex of textiel.
Aseptische verpakking is een productieproces waarbij een steriel product en een steriele verpakking onder aseptische condities worden samengevoegd. De verpakking (folies, flesjes, cups) wordt onafhankelijk van het product gesteriliseerd, bijvoorbeeld met H₂O₂-damp of ETO. Het proces wordt onder meer toegepast in de langhoudbare zuivel, sondevoeding en parenterale geneesmiddelen. De verpakking hoeft niet gekoeld te worden omdat product en verpakking beide steriel zijn en de sluiting hermetisch is.
De vier klassieke fouten van beginners zijn: het openen van verpakkingen te vroeg (buiten de kritische zone), het aanraken van de binnenkant van een dop, het over een open plaat pipetteren waardoor huidschilfers vallen, en het praten of niezen zonder mondbescherming boven een geopende plaat. Alle vier zijn te voorkomen door bewuste, langzame handelingen en door de checklist «materiaal-omgeving-hand-tijd» consequent toe te passen: is mijn materiaal steriel, mijn omgeving beheerst, mijn hand aseptisch, mijn expositietijd minimaal?
Meer achtergrond over de bijbehorende technieken en materialen vindt u in de artikelen over steriel of niet-steriel, autoclaven, laboratoriumbranders, zuurkasten en werkkasten, kweekmedia voor microbiologie, kweken van eencelligen, kiemplaat en kolonietelling, Sterility Assurance Level (SAL) en steriliteitstesten in de farma.
Voor aseptisch werken vindt u bij Labvakhandel de benodigde autoclaven en sterilisatoren, steriele petrischalen en kweekplaten, steriele spuitfilters en bunsen- en teclubranders. Neem contact op voor advies over de juiste combinatie voor uw toepassing.
Disclaimer: De informatie in dit artikel is bedoeld als algemene technische toelichting. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl aanvaardt geen aansprakelijkheid voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische, klinische of industriele situaties. Raadpleeg voor uw eigen toepassing altijd de geldende normen, vakliteratuur en de documentatie van fabrikant en apparatuur.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
