Een spectrofotometer kiest u niet op merk of catalogusprijs, maar op de combinatie van benodigd golflengtegebied, gewenste stabiliteit, monstervolume en meetmodus. Een compacte Vis-fotometer die uitstekend voldoet voor gestandaardiseerde kleurreacties met testkits is ongeschikt voor eiwit- of DNA-metingen in het UV; een microvolume-instrument dat DNA in 1 µl kwantificeert vervangt geen dubbelbundelinstrument voor spectrumopnames of langdurige enzymkinetiek. Deze keuzewijzer leidt u langs de vier beslissende parameters en verwijst voor de achtergrond naar het kennisbankartikel over UV/Vis-spectrofotometrie en het instrumentgerichte artikel over de spectrofotometer als apparaat.
Er bestaat geen universeel “beste” model. Welk apparaat het meest geschikt is, hangt volledig af van uw toepassing, het monstertype en de nauwkeurigheid die u nodig heeft. Een spectrofotometer die uitstekend voldoet voor routine-eiwitbepalingen is in de meeste gevallen geen goede keuze als u ook het UV-gebied nodig heeft of absorptiepieken met een steile curve nauwkeurig wilt bepalen.
De interactieve keuzeboom bovenaan deze pagina brengt u in enkele stappen naar het apparaattype dat het best bij uw situatie past. De beslissende parameters hieronder leggen uit welke eigenschappen daadwerkelijk het verschil maken, zodat u de specificaties van verschillende modellen onderling kunt vergelijken en een gefundeerde keuze maakt.
De eerste vraag is welk deel van het spectrum u moet meten. Het zichtbare gebied (400–800 nm) volstaat voor gekleurde oplossingen, gestandaardiseerde kleurreacties (bijvoorbeeld met testkits voor wateranalyse) en voor didactische demonstraties van de wet van Lambert-Beer. Instrumenten voor uitsluitend het Vis-gebied gebruiken doorgaans een wolfram- of wolframhalogeenlamp en optiek van optisch glas of kunststof. Zodra UV-metingen in beeld komen — eiwitten bij 280 nm, nucleïnezuren bij 260 nm, aromatische farmaceutica, nitraat bij 220 nm — is een instrument met een deuteriumlamp (of pulsed-xenon) én kwartsoptiek vereist. Een standaard-UV/Vis-spectrofotometer bestrijkt typisch circa 190–1100 nm; een pure Vis-fotometer stopt bij 320–340 nm door de transmissiegrens van optisch glas en PMMA. Voor de verschillen tussen fotometer, spectrofotometer en verwante instrumenten zie het artikel over fotometrische en colorimetrische bepalingen.
Bij een enkelbundelinstrument (single beam) loopt één lichtbundel afwisselend door de blanco en het monster: eerst wordt de blanco als nulreferentie opgeslagen, daarna wordt het monster gemeten. Drift van de lichtbron tussen beide metingen wordt niet in real time gecompenseerd. Enkelbundelinstrumenten zijn eenvoudiger, compacter en beter betaalbaar, en voldoen voor de meeste routinemetingen bij een vaste golflengte — mits regelmatig een blanco wordt opgenomen.
Bij een dubbelbundelinstrument (double beam) wordt de lichtbundel gesplitst in twee parallelle paden: één door het monster, één door de referentie. Beide worden gelijktijdig gemeten en het verschil in log(I₀/I) levert direct de absorptie. Lampintensiteitsdrift wordt zo continu gecorrigeerd. Een dubbelbundelinstrument is de aangewezen keuze voor kinetische metingen die minutenlang duren, voor spectrumopnames over een breed golflengtegebied en voor werk waarbij de fotometrische nauwkeurigheid ook bij lage absorptiewaarden (A < 0,1) gehandhaafd moet blijven. Als derde optische opzet bestaat het splitbundel- of reference beam-principe: de bundel wordt via een beam-splitter tussen monster- en referentiepad geschakeld, wat een tussenoplossing biedt tussen enkelbundel en volwaardig dubbelbundel.
De vorm en het volume van uw monsters bepalen het monsterintroductiesysteem. Voor een standaard cuvetinstrument geldt een padlengte van 1 cm en een volume van doorgaans 0,5–4 ml (semi-micro-cuvetten vanaf circa 50 µl). Voor lage concentraties kan de padlengte worden vergroot tot 5 cm; voor hoge concentraties verkleind tot 2 mm of 1 mm. Een microvolume-spectrofotometer (pedestal- of NanoDrop-type) meet 0,5–2 µl zonder cuvet: het monster wordt op een sokkel aangebracht en oppervlaktespanning houdt de vloeistofkolom in de bundel. De padlengte wordt automatisch tot 0,5 of 1 mm ingekort en teruggerekend naar een 1 cm-equivalent, wat het bereik opschuift naar hoge concentraties (typisch DNA/RNA tot enkele mg/ml). Voor high-throughput werk in ELISA, celviabiliteitsassays of eiwitkwantificering in reeksen is een microplaatlezer geschikt: 96-, 384- of 1536-wells platen worden vanaf boven of onder doorstraald, met een padlengte die volgt uit het vulvolume. Bij een microplaatlezer wordt de kalibratie per plaat opgesteld, omdat de padlengte niet 1 cm is.
De laatste beslispunt is hoe u het licht wilt meten. Bij een puntmeting op een enkele golflengte volstaat een instrument met een scannende monochromator en één detector. Voor spectrumopnames over een breed golflengtegebied moet de monochromator het bereik met een instelbare stapgrootte aflopen; hoe hoger de gewenste scansnelheid en resolutie, hoe zwaardere eisen aan de monochromator en detector. Bij een diode-array-detector (DAD/PDA) wordt het polychromatische licht ná het monster gesplitst en op een reeks van typisch 512 of 1024 fotodiodes geprojecteerd, waardoor het volledige spectrum in één opname simultaan wordt gemeten — snel, robuust en zonder bewegende mechanische delen. Diode-array is de standaard in HPLC-detectie en in standalone instrumenten voor snel spectraal werk; zie de achtergrond over de diode-array-detectie. Gerelateerde overwegingen zijn de spectrale bandbreedte (1–2 nm is gangbaar voor routine-UV/Vis) en de gewenste absorptieresolutie; de invloed op detectiegrenzen is uitgewerkt in het artikel over de signaal-ruisverhouding.
De meeste spectrofotometers zijn benchtop-apparaten: ze staan vast opgesteld in het laboratorium en zijn ontworpen voor nauwkeurige, reproduceerbare metingen. Als u monsters altijd naar het lab kunt brengen, is een benchtop-model vrijwel altijd de betere keuze: groter golflengtebereik, smalle spectrale bandbreedte, stabielere lichtbron en een ruimere keuze aan cuvethouders en accessoires.
Draagbare veld-spectrofotometers zijn zinvol als meten op locatie noodzakelijk is — bij milieumonitoring, in-line kwaliteitscontrole buiten het lab of in onderwijssituaties waarbij de apparatuur verplaatst moet worden. Houd dan rekening met de volgende beperkingen:
Het overzicht van apparaattypen verderop op deze pagina toont welke categorieën als draagbaar of veld-instrument worden aangeboden en bij welke toepassingen ze geschikt zijn.
De spectrale bandbreedte (ook wel SBW of slitbreedte) bepaalt hoe smal de golflengtebundel is die op het monster valt. Bij de meeste laboratoriumspectrofotometers ligt dit tussen 0,5 en 8 nm. Hoe kleiner de waarde, hoe scherper het apparaat absorptiepieken kan onderscheiden en hoe nauwkeuriger de extinctiemeting op een precieze golflengte.
Een smalle bandbreedte (0,5–2 nm) is met name van belang bij:
Voor de meeste routinetoepassingen — eiwitbepaling (Bradford, BCA), DNA/RNA-meting bij 260 nm of enzymkinetiek — is een bandbreedte van 2–5 nm ruim voldoende. Eenvoudige Vis-spectrofotometers met een vaste bandbreedte van 5–8 nm voldoen prima voor kleurmetingen en standaard absorptiebepalingen, maar zijn minder geschikt als nauwkeurigheid kritiek is. Het artikel over UV/Vis-spectrofotometrie gaat dieper in op absorptiespectra en de wet van Beer-Lambert.
Bekijk het assortiment spectrofotometers en optisch-onderzoeksapparatuur of neem contact op voor advies bij de keuze van het juiste type voor uw toepassing, monstervolume en golflengte-eisen.
Fotometrische bepalingen van bijvoorbeeld nitraat, fosfaat en ammonium zijn een vast onderdeel van de wateranalyse. Welke parameters daarbij horen, leest u in Wateranalyse: parameters, methoden en laboratorium.
Geschreven door Labvakhandel, specialist in laboratoriumbenodigdheden voor bedrijven en instellingen.
Disclaimer: De informatie in dit artikel is bedoeld als algemene technische toelichting. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl aanvaardt geen aansprakelijkheid voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische, klinische of industriële situaties. Raadpleeg voor uw eigen toepassing altijd de geldende normen, vakliteratuur en de documentatie van fabrikant en apparatuur.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
