Peptidesynthese (Engels: peptide synthesis) is het in het laboratorium opbouwen van een peptide door aminozuren in een vastgelegde volgorde via amidebindingen aan elkaar te koppelen. Synthetische peptiden worden gebruikt als onderzoeksreagens, als standaard in de analytische chemie, als antigeen voor antilichaamproductie, als diagnosticum en als werkzame stof in geneesmiddelen. De chemische synthese maakt het mogelijk sequenties te maken die in de natuur niet voorkomen, zoals peptiden met D-aminozuren, niet-natuurlijke bouwstenen, labels of een cyclische structuur.
Dit artikel richt zich op peptidesynthese als laboratorium- en productietechniek: de chemie achter de koppeling, de vastefasesynthese (SPPS) stap voor stap, de keuze van hars, beschermgroepen en koppelingsreagentia, veelvoorkomende nevenreacties, de afsplitsing, zuivering en analyse van het ruwe peptide, en de apparatuur en veiligheid in het syntheselaboratorium.
Een peptide is een keten van aminozuren die met elkaar zijn verbonden via peptidebindingen: amidebindingen tussen de carboxylgroep van het ene aminozuur en de aminogroep van het volgende, waarbij formeel water wordt afgesplitst. Elke keten heeft een N-terminus met een vrije aminogroep en een C-terminus met een vrije carboxylgroep. De volgorde van de aminozuren, de sequentie, wordt conventioneel van N naar C geschreven in de één- of drieletternotatie.
Naar lengte onderscheidt men dipeptiden (twee aminozuren), tripeptiden, oligopeptiden (tot ongeveer twintig aminozuren) en polypeptiden. In het Nederlands is peptiden de gangbare meervoudsvorm; de Engelse vorm peptides wordt ook veel gebruikt.
Een eiwit is chemisch gezien een lang polypeptide, of een complex van meerdere polypeptideketens. Er is geen scherpe grens; als vuistregel spreekt men bij ketens tot ongeveer 50 aminozuren van peptiden en daarboven van eiwitten. Belangrijker dan de lengte is dat eiwitten doorgaans een stabiele driedimensionale vouwing hebben (secundaire, tertiaire en quaternaire structuur), terwijl korte peptiden in oplossing vaak flexibel zijn. Voor de structuuranalyse van peptiden en eiwitten, zie het artikel over circulair dichroïsme.
Bekende natuurlijke en synthetische peptiden zijn:
Peptidehormonen zijn hormonen die uit een aminozuurketen bestaan, zoals insuline, glucagon, GLP-1, oxytocine, vasopressine, calcitonine en ACTH. Ze worden in de cel via ribosomen als groter precursoreiwit gemaakt en daarna enzymatisch op maat geknipt. Omdat ze in water oplossen en niet door celmembranen gaan, werken ze via receptoren aan het celoppervlak. Veel peptidegeneesmiddelen zijn gemodificeerde analogen van deze hormonen, met een langere halfwaardetijd of een hogere stabiliteit.
Natuurlijke peptiden zijn peptiden die door levende organismen worden gemaakt: hormonen, neuropeptiden, antimicrobiële peptiden uit het afweersysteem, toxinen uit gif van slangen en kegelslakken, en bioactieve peptiden die vrijkomen bij de afbraak van voedseleiwitten, zoals uit melkeiwit (caseïne). Daarnaast maken bacteriën en schimmels niet-ribosomale peptiden, zoals ciclosporine en vancomycine, via grote enzymcomplexen in plaats van ribosomen.
Er is geen officiële indeling in vier soorten; de gangbare indelingen hangen af van het criterium. Naar lengte: di-, tri-, oligo- en polypeptiden. Naar structuur: lineaire, cyclische, vertakte en 'stapled' peptiden (met een chemische brug die een helix fixeert). Naar herkomst: ribosomale, niet-ribosomale, recombinante en chemisch gesynthetiseerde peptiden. Naar functie: hormonen, neuropeptiden, antimicrobiële peptiden en signaalpeptiden.
Peptiden kunnen chemisch, biologisch of met een combinatie van beide worden gemaakt. De keuze hangt af van de lengte, de gewenste modificaties, de schaal en de zuiverheidseisen.
De vastefasesynthese werd in 1963 geïntroduceerd door R. Bruce Merrifield, die er in 1984 de Nobelprijs voor de Scheikunde voor ontving. Het is vandaag de standaardmethode in onderzoekslaboratoria en voor het grootste deel van de peptiden tot enkele tientallen aminozuren.
Chemische peptidesynthese verloopt, anders dan de biosynthese op het ribosoom, van de C-terminus naar de N-terminus. Het eerste aminozuur wordt met zijn carboxylgroep aan de hars verankerd; elk volgend aminozuur wordt aan de vrije aminogroep van de groeiende keten gekoppeld. Omdat aminozuren meerdere reactieve groepen hebben, zijn beschermgroepen nodig: een tijdelijke beschermgroep op de α-aminogroep, die in elke cyclus wordt verwijderd, en permanente beschermgroepen op reactieve zijketens, die pas aan het einde worden verwijderd. Dat de ene groep kan worden verwijderd zonder de andere aan te tasten, heet orthogonaliteit.
Doordat het peptide gedurende de hele synthese aan de hars vast zit, kan elke reactie met een grote overmaat reagens tot volledigheid worden gedreven; alle overmaat wordt eenvoudig weggefiltreerd. Dat maakt SPPS snel en automatiseerbaar.
De Fmoc-strategie is de standaard geworden omdat ze orthogonaal is (base voor de tijdelijke, zuur voor de permanente beschermgroepen) en geen HF vereist. Een praktisch voordeel is dat het afsplitsingsproduct van Fmoc sterk in het UV absorbeert, zodat de ontscherming per cyclus spectrofotometrisch kan worden gevolgd.
De hars is een onoplosbare, zwelbare polymeerdrager, meestal polystyreen verknoopt met 1 procent divinylbenzeen, of een PEG-gebaseerde hars die beter zwelt in polaire oplosmiddelen. De linker tussen hars en peptide bepaalt de C-terminale functie van het eindproduct:
De belading (loading), uitgedrukt in mmol reactieve plaatsen per gram hars, ligt meestal tussen 0,2 en 1,0 mmol/g. Voor lange of moeilijke sequenties wordt bewust een lage belading gekozen, zodat de groeiende ketens elkaar minder hinderen.
Een koppelingsreagens zet de carboxylgroep van het binnenkomende aminozuur om in een reactieve ester, die snel met de aminogroep reageert. De belangrijkste groepen zijn:
Voor reproduceerbare resultaten zijn de zuiverheid van aminozuurderivaten en oplosmiddelen essentieel: sporen dimethylamine in oud DMF kunnen Fmoc-groepen voortijdig afsplitsen, en water verlaagt het rendement van de activering. Zie ook het artikel over zuiverheidsgraden van chemicaliën.
De meest gebruikte controle is de Kaisertest: een kleine hoeveelheid harskorrels wordt verhit met ninhydrine. Een blauwe kleur wijst op vrije primaire aminogroepen, dus op een onvolledige koppeling; kleurloze of gele korrels op een geslaagde koppeling. Omdat proline een secundair amine heeft, wordt na een koppeling op proline de chloraniltest gebruikt. Geautomatiseerde synthesizers volgen daarnaast vaak de UV-absorptie van het Fmoc-afsplitsingsproduct. Is een koppeling onvolledig, dan wordt deze herhaald (dubbele koppeling) voordat de synthese verdergaat.
Elke koppeling en elke ontscherming heeft een rendement dat net onder de 100 procent ligt. Omdat de fouten zich vermenigvuldigen, daalt de theoretische opbrengst aan het juiste volledige peptide snel met de ketenlengte. Bij een rendement r per koppeling en n koppelingen is de fractie correct product rn.
De rest bestaat uit deletiesequenties (één aminozuur ontbreekt) en afgebroken ketens, die chemisch sterk op het doelpeptide lijken en daardoor moeilijk te scheiden zijn. Dit verklaart waarom lange peptiden duurder zijn, waarom capping wordt toegepast en waarom peptiden boven circa 50 aminozuren vaak via fragmentcondensatie, ligatie of recombinante expressie worden gemaakt.
Korte, hydrofiele sequenties zijn met een moderne synthesizer routinewerk. De moeilijkheidsgraad stijgt met de lengte en hangt sterk af van de sequentie. De bekendste problemen zijn:
Verhitting versnelt koppelingen en doorbreekt aggregatie. Daarom werken veel synthesizers met microgolf- of inductieverwarming; de achtergrond daarvan staat in het artikel over microwave-synthese. Verhitting verhoogt echter ook het risico op racemisatie en aspartimidevorming, zodat cysteïne en histidine vaak bij lagere temperatuur worden gekoppeld.
Na de laatste cyclus wordt de N-terminale Fmoc-groep verwijderd (of wordt de N-terminus geacetyleerd) en wordt de hars gewassen en gedroogd. De afsplitsing gebeurt met een mengsel van trifluorazijnzuur (TFA) en scavengers die de vrijkomende reactieve carbokationen afvangen. Een veelgebruikte standaard is TFA, tri-isopropylsilaan en water in de verhouding 95:2,5:2,5; voor peptiden met cysteïne, methionine of tryptofaan worden uitgebreidere mengsels met thiolen gebruikt. De afsplitsing duurt meestal 2 tot 3 uur bij kamertemperatuur.
Het peptide wordt vervolgens van de harskorrels afgefiltreerd en uit het TFA-filtraat neergeslagen in een overmaat koude ether (diethylether of methyl-tert-butylether). Het neerslag wordt afgecentrifugeerd, enkele keren met koude ether gewassen en gedroogd. De techniek van het neerslaan is beschreven in het artikel over precipitatie als scheidingstechniek, het centrifugeren in het artikel over laboratorium centrifuges. Het ruwe peptide wordt opgelost in water/acetonitril en gevriesdroogd; zie vriesdrogen (lyofilisatie).
Peptiden met twee cysteïnes worden na de afsplitsing gecycliseerd door oxidatie in verdunde oplossing, met luchtzuurstof, DMSO of jodium. Bij meerdere disulfidebruggen worden orthogonale cysteïnebeschermgroepen gebruikt (bijvoorbeeld Trt en Acm), zodat de bruggen één voor één in de juiste combinatie worden gevormd. Kop-staartcyclisatie of lactamvorming tussen zijketens vindt plaats op de hars of in sterk verdunde oplossing, om koppeling tussen verschillende moleculen te voorkomen.
Het ruwe peptide bevat naast het doelproduct deletiesequenties, afgebroken ketens en afsplitsingsresten. De standaardzuivering is preparatieve omgekeerde-fase-HPLC op een C18- of C8-kolom met een gradiënt van water naar acetonitril, beide met 0,1 procent TFA. De principes staan in de artikelen over omgekeerde-fase HPLC en gradiëntelutie. De zuivere fracties worden samengevoegd en gevriesdroogd. Het peptide wordt dan verkregen als TFA-zout. Voor celbiologische of in-vivotoepassingen wordt het tegenion vaak uitgewisseld voor acetaat of chloride, omdat TFA-resten biologische assays kunnen verstoren.
Voor onderzoeksdoeleinden volstaat vaak een zuiverheid van meer dan 70 à 80 procent (bijvoorbeeld voor immunisatie of screening). Kwantitatieve assays, structuurstudies en cellulaire experimenten vragen doorgaans meer dan 95 procent; peptidegeneesmiddelen worden gespecificeerd op individuele onzuiverheden.
Peptiden worden gemaakt met een peptidesynthesizer: een geautomatiseerd systeem dat de cyclus van ontschermen, wassen, koppelen en wassen uitvoert door oplosmiddelen en reagentia naar een of meer reactievaten met een filterbodem te doseren en af te zuigen. De gangbare typen zijn:
Handmatige SPPS is op kleine schaal ook goed uitvoerbaar met een glazen reactievat of een kunststof spuit met filterfrit, een schudmachine en een vacuümopstelling om de wasvloeistoffen af te zuigen. Dat is gangbaar in onderwijs en voor het testen van afzonderlijke stappen.
Naast de synthesizer of een handmatige opstelling heeft een peptidelaboratorium doorgaans nodig: een zuurkast voor het werken met TFA, piperidine en ether; een analytische balans; een centrifuge met een rotor voor ethervaste buizen; een rotatieverdamper; een vriesdroger; een preparatieve en een analytische HPLC; toegang tot LC-MS of MALDI-TOF; en een koelkast en vriezer voor de opslag van aminozuurderivaten en eindproducten. Fmoc-aminozuren en koppelingsreagentia worden koel en droog bewaard en op kamertemperatuur gebracht voordat de verpakking wordt geopend, om condensatie van vocht te voorkomen.
Peptidesynthese werkt met een aantal gevaarlijke stoffen. TFA is een sterk en vluchtig zuur dat ernstige brandwonden veroorzaakt. Piperidine is giftig, brandbaar en corrosief. DMF en NMP zijn reproductietoxisch. Carbodi-imiden zoals DIC en veel koppelingsreagentia zijn sensibiliserend, en watervrij HOBt kan explosief ontleden; Oxyma is een veiliger alternatief. Diethylether is extreem brandbaar en vormt peroxiden. Werk daarom in een zuurkast, gebruik geschikte handschoenen en oogbescherming, en raadpleeg per stof het veiligheidsinformatieblad. Gehalogeneerd en niet-gehalogeneerd afval en zure afsplitsingsresten worden gescheiden ingezameld; zie laboratoriumafvalbeheer.
SPPS verbruikt veel oplosmiddel: vooral het wassen tussen de stappen zorgt ervoor dat per kilogram peptide vele honderden tot duizenden kilogrammen afval ontstaan. DMF, het klassieke SPPS-oplosmiddel, valt sinds eind 2023 onder een beperking in de Europese REACH-verordening, die strengere eisen stelt aan de blootstelling van werknemers. Actuele informatie per stof vindt u bij het Europees Agentschap voor chemische stoffen (ECHA). Daarom wordt veel onderzoek gedaan naar alternatieve oplosmiddelen en mengsels, naar minder wasstappen en naar vloeistoffasemethoden met een lager oplosmiddelverbruik.
Het synthetiseren van peptiden voor onderzoek, onderwijs, diagnostiek of als tussenproduct is in Nederland gewoon toegestaan, binnen de regels voor het werken met gevaarlijke stoffen en de registratieplichten die voor sommige grondstoffen gelden. Piperidine staat bijvoorbeeld op de internationale lijst van drugsprecursoren; controleer bij inkoop en opslag de geldende verplichtingen. Een peptide dat bedoeld is voor toediening aan mensen is een geneesmiddel en valt onder de Geneesmiddelenwet: productie vereist een fabrikantenvergunning en GMP, en het in de handel brengen een handelsvergunning. Informatie over de registratie en het toezicht vindt u bij het College ter Beoordeling van Geneesmiddelen en de Inspectie Gezondheidszorg en Jeugd. Peptiden die worden verkocht met de aanduiding 'research use only' zijn uitsluitend bedoeld voor laboratoriumonderzoek.
Peptidesynthese is een laboratoriumtechniek die een ingericht chemisch laboratorium, geschoold personeel en analytische apparatuur vraagt. Zonder zuivering en analyse is niet vast te stellen of het product het juiste peptide is, hoe zuiver het is en welke resten van giftige reagentia het bevat. Buiten een professionele laboratoriumomgeving is peptidesynthese daarom niet verantwoord. Onderzoeksgroepen zonder eigen syntheseapparatuur besteden peptiden doorgaans uit aan gespecialiseerde syntheselaboratoria.
Peptidegeneesmiddelen worden geproduceerd volgens GMP. Voor werkzame stoffen gelden onder meer de ICH-kwaliteitsrichtlijnen, waaronder Q7 voor de productie van werkzame stoffen en Q11 voor de ontwikkeling daarvan. De vraag naar peptidegeneesmiddelen, met name GLP-1-analogen, heeft geleid tot productie op grote schaal en tot een sterke ontwikkeling van hybride synthese, vloeistoffasemethoden en duurzamere processen.
Peptiden combineren een hoge specificiteit en werkzaamheid met een relatief lage toxiciteit, omdat ze worden afgebroken tot aminozuren. Daar staan duidelijke nadelen tegenover:
De kosten worden bepaald door de lengte van de sequentie, de gewenste zuiverheid, de hoeveelheid, modificaties (zoals labels, cyclisatie of niet-natuurlijke aminozuren) en de moeilijkheidsgraad van de sequentie. Een kort, onbewerkt peptide van onderzoekskwaliteit in milligramhoeveelheden is relatief eenvoudig te maken; een lang, hoogzuiver of meervoudig gemodificeerd peptide vraagt meer cycli, dubbele koppelingen en uitgebreide zuivering, en is daardoor aanzienlijk bewerkelijker. Bij grootschalige productie bepalen vooral de kosten van aminozuurderivaten, oplosmiddelen en zuivering de kostprijs.
Op onderzoeksschaal is de synthese van korte peptiden met moderne synthesizers routinematig. Op productieschaal is het een complex proces: grote volumes oplosmiddel, strenge eisen aan onzuiverheden, uitgebreide zuivering en validatie onder GMP. Lange en hydrofobe sequenties blijven op elke schaal lastig.
Nee. Peptiden zijn ketens van aminozuren; steroïden zijn lipiden met een kenmerkend skelet van vier gefuseerde koolstofringen, afgeleid van cholesterol. Ze verschillen in chemische structuur, in de manier waarop ze worden gemaakt en in hun werkingsmechanisme: steroïdhormonen passeren celmembranen en werken via receptoren in de cel, peptidehormonen via receptoren aan het celoppervlak.
Als werkzame stof hebben peptiden een lage orale biologische beschikbaarheid, een korte halfwaardetijd, beperkte stabiliteit in oplossing en relatief hoge productiekosten. Voor het syntheselaboratorium komen daar de dalende opbrengst bij lange sequenties, aggregatie op de hars, nevenreacties zoals racemisatie en aspartimidevorming, en het hoge oplosmiddelverbruik bij.
Synthetische peptiden worden gebruikt als antigeen voor de productie van antilichamen, als epitoop in ELISA en andere immunoassays, als substraat of remmer in enzymonderzoek, als standaard voor kwantitatieve massaspectrometrie in proteomics, voor het onderzoek naar eiwit-eiwitinteracties, als celpenetrerend of targetingpeptide, en als kandidaat-geneesmiddel in de farmaceutische ontwikkeling.
Bij de biosynthese in de cel leest het ribosoom een mRNA-molecuul af en bouwt de keten op van de N-terminus naar de C-terminus, met uitsluitend de twintig standaardaminozuren (plus enkele bijzondere). Chemische synthese verloopt van de C- naar de N-terminus, vraagt beschermgroepen en is in lengte beperkt, maar maakt vrijwel elke gewenste bouwsteen en modificatie mogelijk.
Bent u op zoek naar chemicaliën, glaswerk of apparatuur voor een peptidelaboratorium? Bekijk ons aanbod van chemicaliën en oplosmiddelen, slijpstuk glaswerk, schudmachines en laboratorium centrifuges.
Disclaimer: De informatie in dit artikel is bedoeld als technische achtergrond voor professioneel laboratoriumgebruik en vervangt niet de specifieke gebruiksaanwijzingen van fabrikanten, de geldende veiligheidsvoorschriften en vakpublicaties. Dit artikel bevat geen advies over het gebruik van peptiden bij mensen; peptiden die voor toediening aan mensen bestemd zijn, vallen onder de geneesmiddelenwetgeving. Raadpleeg bij twijfel altijd de veiligheidsinformatiebladen en de relevante vakliteratuur.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
