Na gelelektroforese zijn eiwitten onzichtbaar in de polyacrylamidegel. Pas een kleurstap maakt de bandpatronen zichtbaar en bruikbaar voor zuiverheidscontrole, massabepaling of kwantitatieve vergelijking. Dit artikel beschrijft de twee meest toegepaste kleuringsmethoden — Coomassie Brilliant Blue en zilverkleuring — in detail: het bindingsmechanisme, stapsgewijze protocollen, detectiegrenzen, kwantificeringsmogelijkheden en compatibiliteit met vervolganalyses zoals massaspectrometrie.
Eiwitten absorberen UV-licht bij 280 nm, maar die absorptie is in een gel onvoldoende voor directe detectie. Een post-elektroforetische kleuring is daarom vrijwel altijd nodig om te beoordelen hoeveel banden aanwezig zijn, hoe zuiver een preparaat is en of de verwachte molecuulmassa klopt. De keuze van de kleuring beïnvloedt drie praktische aspecten direct: de laagste detecteerbare hoeveelheid eiwit (gevoeligheid), de nauwkeurigheid waarmee bandintensiteiten onderling vergeleken kunnen worden (kwantificering) en de mogelijkheid om banden achteraf te identificeren via massaspectrometrie (MS-compatibiliteit).
Na een zuiveringstraject geeft gelkleuring visueel bewijs van zuiverheid: elke afwezige contaminantband bevestigt dat de stap heeft gewerkt.
Coomassie Brilliant Blue is een organische kleurstof die niet-covalent aan eiwitten bindt en banden als donkerblauwe zones op een heldere achtergrond toont. De methode is eenvoudig, robuust en levert detectiegrenzen van circa 50–100 ng per band (klassiek) of 10–50 ng (colloïdaal). Zilverkleuring berust op een heel ander principe: zilverionen worden selectief gereduceerd tot metallisch zilver op plaatsen waar eiwit aanwezig is, waardoor bruinzwarte banden ontstaan met een detectiegrens van 0,05–1 ng per band — tot 100 keer gevoeliger dan klassiek Coomassie. Het verschil in gevoeligheid gaat gepaard met een verschil in gebruiksgemak: zilverkleuring vergt meer stappen, een striktere timing en geeft een smaller lineair kwantificeringsbereik.
De Coomassie-kleurstoffamilie bestaat uit trifenylmethaan-derivaten met sulfonaatgroepen. De twee meest gebruikte varianten zijn Coomassie Brilliant Blue R-250 en Coomassie Brilliant Blue G-250. Het verschil zit in een extra methylgroep bij G-250, waardoor de kleur iets groener is (de "G" staat voor groen, de "R" voor roodachtig) en de oplosbaarheid in zure omgeving lager — een eigenschap die de basis vormt voor colloïdale formuleringen.
Het bindingsmechanisme combineert drie typen interacties: (1) elektrostatische binding tussen de negatief geladen sulfonaatgroepen van de kleurstof en positief geladen aminozuurresiduen (arginine, lysine, histidine), (2) hydrofobe interacties met apolaire zijketens van aminozuren als tryptofaan, tyrosine en fenylalanine, en (3) Van der Waals-krachten. In zuur milieu (azijnzuur/methanol) is de kleurstof in de cationische, protonated vorm die het sterkst aan eiwitten bindt. Bij ontkleuring laat de kleurstof geleidelijk los van de gelmatrix maar blijft gebonden aan de eiwitten, waardoor banden contrasteren tegen een heldere achtergrond.
De intense blauwe kleur ontstaat door het uitgebreide geconjugeerde pi-systeem van de trifenylmethaanstructuur. Dit systeem absorbeert licht in het oranje-rode deel van het spectrum (absorptiemaximum circa 595 nm voor R-250 en 612 nm voor G-250), waardoor complementair blauw licht wordt doorgelaten. De binding aan eiwit verschuift het absorptiemaximum licht, maar de kleur blijft visueel blauw. Vrije kleurstof in oplossing kan rood-bruin lijken (R-250) of groenachtig (G-250) afhankelijk van de pH.
De naam Coomassie heeft geen chemische betekenis maar een historische: hij verwijst naar de stad Kumasi (destijds gespeld als Coomassie) in het huidige Ghana. Tijdens de Britse koloniale expeditie naar Ashanti in 1896 werd de naam door de textielindustrie verbonden aan een groep blauwe kleurstoffen die rond die tijd werd ontwikkeld — een destijds gangbare marketinggewoonte om producten te verbinden aan actuele gebeurtenissen.
De kleurstoffen die later in het laboratorium hun intrede deden — Coomassie Brilliant Blue R-250 en G-250 — zijn een subgroep van die familie. De naam zegt dus niets over de chemie of werking van de kleurstof; daarvoor is de aanduiding trifenylmethaankleurstof (ook wel triarylmethaankleurstof) de correcte term. In wetenschappelijke literatuur worden de twee varianten consequent aangeduid als CBB R-250 en CBB G-250, waarbij CBB staat voor Coomassie Brilliant Blue.
De kleuringsintensiteit van Coomassie is eiwitafhankelijk omdat de binding berust op de aminozuursamenstelling en de driedimensionale toegankelijkheid van specifieke residuen. Positief geladen residuen — arginine, lysine en histidine — leveren de sterkste elektrostatische interactie met de sulfonaatgroepen van de kleurstof. Argininerijke eiwitten kleuren daardoor intensiever dan eiwitten met weinig basische residuen bij een vergelijkbare massa. Hydrofobe residuen als tryptofaan, tyrosine en fenylalanine dragen bij via hydrofobe interacties; hun bijdrage is groter naarmate ze aan het eiwitoppervlak liggen. Dit heeft drie praktische gevolgen:
Voor nauwkeurige kwantificering verdient het aanbeveling de kalibratiestandaard (bijv. BSA) te vervangen door het te kwantificeren eiwit zelf, of gebruik te maken van een totaaleiwit-kwantificeringsmethode in oplossing als absolute referentie.
Coomassie Brilliant Blue is in de kleur- en ontkleurbaden — die azijnzuur en methanol bevatten — overwegend negatief geladen. De sulfonaatgroepen (−SO3−) in de molecuulstructuur dragen een permanente negatieve lading, ook bij lage pH. Dankzij die negatieve lading zoekt de kleurstof de positief geladen aminozuurresiduen in het eiwit op — met name arginine, lysine en histidine — via elektrostatische aantrekking.
Bij een hogere pH (meer basisch) kan de kleurstof zelf deels anders geladen zijn en verandert de absorptiekleur; daarom worden kleurings- en ontkleurstappen altijd in een zuur milieu uitgevoerd. In de cationische (geprotoneerde) vorm bij lage pH is de elektrostatische binding met eiwitten het sterkst, wat het contrast na ontkleuring maximaliseert.
Ter vergelijking: bij SDS-PAGE zijn de eiwitten zelf negatief geladen door het SDS-omhulsel. Tijdens de kleuring, die plaatsvindt na elektroforese, is het SDS grotendeels uitgewassen en zijn de positief geladen residuen weer beschikbaar voor binding met de kleurstof.
Het standaardprotocol met Coomassie R-250 is robuust en vergevingsgezind qua timing. Het bestaat uit drie stappen:
De detectiegrens van dit protocol ligt bij circa 100–500 ng eiwit per band. Het lineaire kwantificeringsbereik loopt van ongeveer 0,5 tot 20 µg per band; daarboven treedt verzadiging op en vertekent densitometrie de werkelijke verhoudingen.
Ja, Coomassie-kleuring is volledig reversibel. De binding van de kleurstof aan eiwitten berust op niet-covalente interacties (elektrostatisch, hydrofob, Van der Waals) die verbroken worden door het methanol/azijnzuur-ontkleurbad. Dit heeft twee praktische gevolgen:
Houd er rekening mee dat herhaalde kleurcycli het lineaire bereik voor densitometrische kwantificering kunnen beïnvloeden. Voor kwantitatieve toepassingen verdient een eenmalige, geoptimaliseerde kleurstap de voorkeur.
Voor klassiek R-250 is een kleuringsduur van meer dan 4 uur zelden nodig, maar een overnachtincubatie schaadt de gel niet. De banden worden iets intenser, maar de achtergrond stijgt evenredig mee, zodat het contrast per saldo nauwelijks verbetert. Een langere ontkleuringstijd compenseert de donkerdere achtergrond. Voor colloïdaal Coomassie G-250 is overnachtkleuring (8–16 uur) juist de aanbevolen standaard: de colloïdale deeltjes dringen langzamer door in de gel en bereiken dan pas hun maximale signaal-ruisverhouding. Gels kunnen in afgesloten bakken of zakken bij kamertemperatuur overnacht blijven staan zonder kwaliteitsverlies.
De colloïdale variant gebruikt G-250 in een oplossing met ammoniumsulfaat en fosforzuur. In deze omgeving vormt de kleurstof colloïdale deeltjes die te groot zijn om de gelmatrix binnen te dringen maar klein genoeg om in de poriën te diffunderen waar eiwit aanwezig is. Het resultaat is een kleurstap die nauwelijks achtergrond geeft en daarom weinig tot geen ontkleuring vereist.
Een veelgebruikt protocol (Candiano et al., 2004 / Neuhoff et al., 1988):
De detectiegrens bedraagt 10–50 ng per band — vijf- tot tienmaal gevoeliger dan klassiek R-250. Het protocol is bovendien volledig compatibel met in-gel-digestie voor massaspectrometrie, omdat de kleurstof de eiwitten niet covalent modificeert en geen aldehydevernettingsmiddelen bevat.
Voor de meeste toepassingen heeft colloïdaal Coomassie G-250 de voorkeur boven klassiek R-250. De gevoeligheid is hoger, de achtergrondkleuring is lager, ontkleuring is nauwelijks nodig en de methode is direct MS-compatibel. Klassiek R-250 blijft nuttig in situaties waar snelheid belangrijker is dan gevoeligheid (resultaat binnen enkele uren versus overnacht) en als een eenvoudige visuele bevestiging van abundante eiwitten volstaat.
Coomassie Brilliant Blue is ontwikkeld voor polyacrylamidegels (PAGE) en is niet geschikt als standaardmethode voor agarosegels. Agarosegels worden vrijwel uitsluitend gebruikt voor nucleïnezuurscheiding (gelelektroforese van DNA en RNA), waarbij ethidiumbromide of fluorescerende alternatieven zoals SYBR Green de gebruikelijke kleuringen zijn. Coomassie bindt weliswaar aan eiwitten die in een agarosegel aanwezig zijn, maar de open, poreuze structuur van agarose geeft een hoge achtergrondkleuring en maakt een effectieve ontkleuring moeilijk. Voor eiwitscheiding in agarose — een niche-toepassing bij zeer grote eiwitcomplexen of bij bepaalde native gelelektroforese-varianten — worden gespecialiseerde protocollen met lage kleurstofconcentraties en uitgebreide wasstappen toegepast. Voor routine-eiwitanalyse geldt: gebruik polyacrylamide voor eiwitten, agarose voor nucleïnezuren.
Zilverkleuring is de gevoeligste niet-radioactieve methode voor eiwitdetectie in polyacrylamidegels. Het principe berust op de selectieve reductie van zilverionen (Ag+) tot metallisch zilver (Ag0) op plaatsen waar eiwit in de gel aanwezig is. De metaaldeeltjes absorberen en verstrooien licht, waardoor bruinzwarte tot gele banden ontstaan.
De chemie verloopt in vier fasen:
De reactie wordt gestopt met azijnzuur of een EDTA-oplossing om verdere reductie te blokkeren.
Bij zilverkleuring verschijnen bepaalde eiwitten als lichte of kleurloze zones tegen een donker wordende achtergrond — zogeheten "negatieve" banden. Dit fenomeen treedt op wanneer grote hoeveelheden eiwit de zilverionen zo snel binden dat de lokale concentratie zilver uitgeput raakt voordat de ontwikkeling begint. Bovendien beïnvloeden de aminozuursamenstelling en posttranslationele modificaties (met name glycosylering) de affiniteit voor zilverionen. Glyoproteïnen kleuren bij zilver vaak aanzienlijk zwakker dan niet-geglycosyleerde eiwitten van vergelijkbare massa. Negatieve banden zijn een diagnostisch artefact: ze wijzen op overbelading of op een eiwit met afwijkende zilverbinding.
Sequentiële kleuring — eerst Coomassie, daarna zilver — is technisch mogelijk maar vereist een volledige ontkleuring als tussenstap. De werkwijze is als volgt: kleuring met colloïdaal Coomassie G-250 geeft een eerste beeld van abundante banden; vervolgens wordt de gel volledig ontkleurd via meerdere wissels methanol/azijnzuur totdat de gel kleurloos is. Daarna kan het zilverkleuringsprotocol worden uitgevoerd op dezelfde gel.
In de praktijk wordt deze sequentie zelden toegepast, om twee redenen. Ten eerste zijn de gevoeligheidsgebieden complementair: als Coomassie een band detecteert, is de hoeveelheid eiwit per definitie boven de Coomassie-detectiegrens en heeft extra zilverkleuring weinig toegevoegde waarde voor diezelfde band. Ten tweede kunnen Coomassie-resten die in de gelmatrix achterblijven de zilverreductie plaatselijk verstoren en artefacten veroorzaken. De aanbevolen aanpak wanneer zowel abundante als lage-abundantie eiwitten in één experiment zichtbaar moeten zijn, is het laden van een gel met twee verschillende hoeveelheden van hetzelfde monster: één lane voor Coomassie, één voor zilver.
Het volgende protocol is gebaseerd op de methode van Shevchenko et al. en is MS-compatibel doordat het geen glutaaraldehyde bevat:
De detectiegrens van dit protocol ligt bij 0,5–2 ng per band. Klassieke protocollen met glutaaraldehyde-sensibilisatie halen 0,05–0,1 ng per band maar zijn onverenigbaar met massaspectrometrische vervolg-analyse.
Een standaard zilverkleuringsprotocol duurt 2–3 uur inclusief alle was- en incubatiestappen. Snelle "speed silver"-protocollen reduceren de totale duur tot circa 30–60 minuten door de incubatietijden te verkorten en hogere reagensconcentraties te gebruiken, maar leveren doorgaans iets minder gevoeligheid en meer achtergrond. Voor routinewerk is het standaardprotocol betrouwbaarder.
Het "lineair bereik" geeft aan over hoeveel ordes van grootte de signaalintensiteit evenredig is met de eiwitconcentratie. Een groot lineair bereik is cruciaal voor betrouwbare kwantitatieve vergelijking van banden op één gel. Zilverkleuring heeft het smalste bereik, waardoor kwantificering alleen betrouwbaar is binnen een beperkt concentratievenster.
In absolute termen is klassieke zilverkleuring (met glutaaraldehyde) het gevoeligst: detectie vanaf 0,05 ng eiwit per band. Voor toepassingen waarin kwantitatieve betrouwbaarheid en MS-compatibiliteit meewegen, biedt fluorescente kleuring (SYPRO Ruby of Coomassie NIR-fluorescent) de beste balans: vergelijkbare gevoeligheid (1–2 ng), een veel groter lineair bereik en geen chemische modificatie van het eiwit.
Het gevoeligheidsverschil vloeit voort uit een fundamenteel verschil in detectiemechanisme. Coomassie is een passieve kleurstof: elk kleurstofmolecuul dat aan een eiwit bindt, draagt precies één molecuul kleur bij aan het signaal. De detectiegrens wordt bepaald door het aantal bindingsplaatsen op het eiwit en de extinctiecoëfficiënt van de kleurstof.
Zilverkleuring werkt via een katalytische versterking. Elk zilverion dat op een eiwitgebonden nucleatieplaats wordt gereduceerd tot metallisch zilver, fungeert als kiem voor verdere zilverreductie in de ontwikkelstap. Één enkel eiwitmolecuul kan zo aanleiding geven tot de depositie van vele zilveratomen, die samen een macroscopisch zichtbare kleurintensiteit produceren. Dit is vergelijkbaar met het principe van fotografische filmontwikkeling. Het resultaat is een signaalmultiplicatie die de detectiegrens tot 100 keer lager legt dan klassiek Coomassie. Het nadeel van deze versterking is dat ook kleine variaties in timing, temperatuur en reagensconcentratie het signaal disproportioneel beïnvloeden, wat het protocol gevoeliger maakt voor artefacten en moeilijker te kwantificeren.
Kwantificering van gelkleuring berust op fotometrische meting van bandintensiteiten. De gel wordt gescand of gefotografeerd met een geldocumentatiestysteem (gel doc), flatbedscanner of fluorescentie-imager. Software berekent vervolgens het piekoppervlak van elke band — een maat die evenredig is met de hoeveelheid eiwit, mits de kleuring zich in het lineaire bereik bevindt.
De meest gebruikte werkwijze is densitometrie via beeldanalyse. Een typische workflow bestaat uit vijf stappen:
Veelgebruikte software is ImageJ/Fiji (open source), GelAnalyzer (gratis) en de proprietary packages die bij gel-doc-systemen worden geleverd. Voor gevalideerde methoden is het belangrijk om het lineaire bereik van de gekozen kleuring vooraf te kalibreren met een verdunningsreeks van een referentie-eiwit (bijv. BSA) op dezelfde gel.
Buiten het lineaire bereik is de relatie tussen eiwitconcentratie en signaalintensiteit niet meer evenredig. Bij verzadiging (plateau) levert een verdubbeling van de eiwitconcentratie nauwelijks extra signaal, waardoor kwantitatieve vergelijking misleidend wordt. Coomassie heeft een lineair bereik van circa 1,5 ordes van grootte, wat volstaat voor ruwe zuiverheidsschattingen maar beperkt is voor nauwkeurige relatieve kwantificering. Fluorescente kleurstoffen (3–4 ordes) en stain-free technologie bieden hier een duidelijk voordeel.
Wanneer eiwitbanden na elektroforese geïdentificeerd moeten worden, worden ze uit de gel gesneden en via in-gel trypsinedigestie voorbereid voor massaspectrometrische analyse (LC-MS/MS). De kleuringsmethode mag dit proces niet blokkeren. Drie factoren zijn bepalend:
De aanbeveling voor proteomics-workflows is: gebruik colloïdaal Coomassie G-250 als standaard. Kies MS-compatibele zilverkleuring alleen wanneer de eiwitconcentratie onder de Coomassie-detectiegrens ligt. Zie ook het kennisbankartikel over proteomics en 2D-PAGE voor de toepassing in tweedimensionale gels.
Colloïdaal Coomassie G-250 wordt breed beschouwd als de beste keuze voor in-gel-digestie en LC-MS/MS. De kleurstof modificeert eiwitten niet covalent, laat zich eenvoudig uitwassen, en de peptiderecovery is hoog. Fluorescente kleuringen (SYPRO Ruby) zijn eveneens uitstekend MS-compatibel en bieden meer gevoeligheid. Klassiek zilver is alleen geschikt als het protocol geen glutaaraldehyde en geen formaldehyde in de fixatiestap bevat.
Naast Coomassie en zilver bestaan fluorescente kleurstoffen die eiwitten in de gel labelen en met een fluorescentie-scanner worden gedetecteerd. Voorbeelden zijn SYPRO Ruby, SYPRO Orange, Flamingo, Krypton en Oriole. Deze stoffen binden aan de SDS-eiwitmantel of aan de eiwitten zelf via hydrofobe interacties.
De voordelen ten opzichte van klassieke kleuringen zijn aanzienlijk: een detectiegrens van 1–2 ng per band, een lineair dynamisch bereik van drie tot vier ordes van grootte, geen fixatie of ontkleuring nodig en volledige compatibiliteit met massaspectrometrie. Het belangrijkste nadeel is de noodzaak van een fluorescentiescanner of -imager; met het blote oog zijn de banden niet of nauwelijks zichtbaar. Daarnaast zijn de reagentia kostbaarder dan Coomassie of zilvernitraat.
Een recente ontwikkeling is het gebruik van Coomassie G-250 als nabij-infrarood (NIR) fluorescente stain. Dezelfde gel die visueel blauw wordt gekleurd, kan aanvullend worden gescand bij 700 nm excitatie. De NIR-fluorescentie van Coomassie levert een gevoeligheid van minder dan 1 ng per band en een lineair bereik van drie tot vier ordes — vergelijkbaar met of beter dan SYPRO Ruby — zonder extra reagentia of een apart kleuringsprotocol.
Stain-free technologie is een detectiemethode waarbij geen kleurstof nodig is. De methode berust op de fotochemische activering van tryptofaanresiduen in het eiwit door UV-licht (circa 302 nm). Tijdens de polymerisatie van de gel worden trihalo-verbindingen in de gelmatrix opgenomen die onder UV-bestraling reageren met tryptofaan en een fluorescent adduct vormen. Na elektroforese volstaat een UV-activering van 45–60 seconden in een geschikte imager om de eiwitbanden zichtbaar te maken — zonder kleur-, was- of ontkleurstap.
De vergelijking met Coomassie op vier punten:
Een belangrijk voorbehoud is de tryptofaanafhankelijkheid: eiwitten met weinig of geen tryptofaanresiduen worden niet of zwak gedetecteerd. Dit maakt stain-free minder universeel dan Coomassie, dat via meerdere bindingstypen aan vrijwel elk eiwit hecht. Voor routinematige verificatie van eiwitexpressie en zuiveringsstappen waarbij snelheid prioriteit heeft en de eiwitsamenstelling bekend is, biedt stain-free een praktisch voordeel. Voor onbekende monsters of vergelijkende kwantificering van diverse eiwitten blijft colloïdaal Coomassie G-250 de betrouwbaardere keuze.
De bereiding verschilt per variant:
Klassiek R-250 (stockoplossing 0,1 %): Los 1 g Coomassie Brilliant Blue R-250 op in 450 ml methanol. Voeg 100 ml ijsazijn toe en vul aan tot 1000 ml met gedestilleerd water. Filtreer de oplossing vóór gebruik door filtreerpapier (bv. kwalitatief filtreerpapier) om onopgeloste kleurstofdeeltjes te verwijderen die anders vlekken op de gel geven. De oplossing is bij kamertemperatuur maanden houdbaar in een afgesloten fles.
Colloïdaal G-250 (Neuhoff-formule): Los 0,12 g Coomassie Brilliant Blue G-250 op in 100 ml methanol. Voeg 200 ml fosforzuur (85 %) toe, daarna 100 g ammoniumsulfaat. Vul aan tot 1000 ml met gedestilleerd water. Deze oplossing vormt bij kamertemperatuur vanzelf een stabiele colloïdale suspensie; filtreren is niet noodzakelijk. De bereiding vereist zorgvuldige volgorde om precipitatie te vermijden.
Praktische tips:
Zowel Coomassie- als zilverkleuringsprotocollen gebruiken chemicaliën die zorgvuldig behandeld moeten worden. Methanol is vluchtig en toxisch bij inademing; werk in de zuurkast of zorg voor goede ventilatie. Azijnzuur (geconcentreerd) is corrosief. Formaldehyde is carcinogeen (CMR-stof categorie 1B); minimaliseer blootstelling en draag nitril handschoenen. Zilvernitraat veroorzaakt donkere, hardnekkige vlekken op huid en kleding en is milieubelastend.
De kleur- en ontkleurbaden van een Coomassie- of zilverkleuring worden doorgaans op een wieg- of lineaire schudder uitgevoerd, zodat de kleurstof gelijkmatig over de gel wordt verdeeld zonder schuim of scheuren. Voor de vergelijking tussen wieg-, lineaire en 3D-platformen: zie de keuzewijzer voor schudmachines.
Coomassie Brilliant Blue zelf heeft een lage acute toxiciteit: de kleurstof is niet ingedeeld als CMR-stof en vormt bij normaal laboratoriumgebruik geen significant inhalatierisico. De oplosmiddelen in de kleur- en ontkleurbaden zijn echter wél gevaarlijk. Methanol is toxisch bij opname via inademing, huid of inslikken en kan het gezichtszenuwen beschadigen bij chronische blootstelling. Azijnzuur (geconcentreerd) is corrosief voor huid en slijmvliezen. Formaldehyde, gebruikt in zilverkleuringsprotocollen, is een carcinogeen (CMR-categorie 1B). Draag bij alle kleuringsstappen nitril handschoenen, werk in de zuurkast of zorg voor adequate ventilatie, en raadpleeg de veiligheidsinformatiebladen van alle gebruikte reagentia.
Afvalverwerking: Coomassie Brilliant Blue zelf is niet ingedeeld als gevaarlijk afval op basis van de kleurstof alleen, maar de kleur- en ontkleurbaden bevatten methanol en azijnzuur, die de vloeistof classificeren als brandbaar chemisch afval. Methanolhoudende afvalstromen mogen niet via het riool worden afgevoerd; verzamel ze gescheiden in chemisch afvalvaten. Sterk verdunde oplossingen (bijv. waswater met sporen azijnzuur en kleurstof zonder methanol) kunnen afhankelijk van lokale regelgeving en het afvalwaterprotocol van uw instelling beperkt via de afvoer worden verwijderd; raadpleeg hiervoor de milieu-coördinator van uw organisatie.
Filtreren van de kleuroplossing: Na herhaald gebruik vormen zich in klassieke R-250-oplossingen onopgeloste kleurstofdeeltjes die vlekken op de gel achterlaten. Filter de gebruikte oplossing vóór hergebruik door kwalitatief filtreerpapier (bv. Grade 1 of equivalent, poriegrootheid 11 μm) in een trechterset op standaard laboratoriumapparatuur. Colloïdale G-250-oplossingen hoeven niet te worden gefilterd; de colloïdale deeltjes maken deel uit van het werkzame mechanisme en mogen niet worden verwijderd.
Afvaloplossingen van zilverkleuring bevatten zware metalen en mogen niet via het riool worden afgevoerd. Verzamel ze gescheiden als chemisch afval. Methanolhoudende kleur- en ontkleurbaden zijn brandbaar en vallen eveneens onder het chemisch afval.
De keuze hangt af van drie factoren: de verwachte eiwitconcentratie op de gel, de noodzaak van kwantitatieve vergelijking en de vervolganalyse. Voor routinematige zuiverheidscontrole na SDS-PAGE of voor het beoordelen van fracties uit een affiniteitschromatografie volstaat klassiek Coomassie R-250. Wanneer ook een massaspectrometrische identificatie volgt, is colloïdaal Coomassie G-250 de betere keuze. Voor sporendetectie — bijvoorbeeld het opsporen van contaminanten in een gezuiverd preparaat of het visualiseren van laag-abundante eiwitten in een 2D-gel — is zilverkleuring of fluorescente detectie nodig. Bij kwantitatieve proteomics met brede concentratiespreiding geeft fluorescente kleuring de betrouwbaarste resultaten dankzij het grote lineaire bereik.
Na western blot-transfer is kleuring van de gel overigens niet meer nodig voor detectie — het membraan wordt daar met antilichamen behandeld. Een tussentijdse Coomassie-kleuring van het membraan (of Ponceau S) kan echter als laadcontrole dienen.
In de gangbare werkwijze wordt een gel eerst gemigreerd en daarna onmiddellijk overgebracht op een membraan voor western blot; Coomassie-kleuring vindt dan niet meer op de gel plaats. Toch zijn er situaties waarbij kleuring voorafgaat aan of gecombineerd wordt met een blot:
De conclusie is dat Coomassie-kleuring en western blot in de praktijk niet worden gecombineerd op dezelfde gel in dezelfde analysecyclus, maar dat postcleuring van de gel na blotting wel degelijk informatief kan zijn als kwaliteitscontrole van de transferstap.
Ponceau S en Coomassie Brilliant Blue zijn beide eiwitkleurstoffen, maar ze worden in verschillende stappen van de workflow ingezet. Coomassie kleurt eiwitten in de polyacrylamidegel na SDS-PAGE; Ponceau S kleurt eiwitten op een membraan (nitrocellulose of PVDF) na western blot-transfer. Het verschil in toepassingsgebied hangt samen met de aard van de binding: Ponceau S is een azo-kleurstof die reversibel aan eiwitten bindt en volledig kan worden uitgewassen met water, zodat het membraan daarna beschikbaar blijft voor antilichaamdetectie. Coomassie is in een gel moeilijker volledig te verwijderen en wordt zelden op membranen toegepast.
Een tweede veelvoorkomende verwarring betreft de naam Brilliant Blue. Coomassie Brilliant Blue (R-250 of G-250) is een laboratoriumkleurstof voor eiwitdetectie en is niet hetzelfde als Brilliant Blue FCF (ook bekend als E133 of FD&C Blue No. 1), een synthetische voedingskleurstof die structureel verwant is maar uitsluitend in de voedingsindustrie wordt gebruikt. De namen overlappen, maar de toepassingen en zuiverheidsgraden zijn niet uitwisselbaar.
Nee — Coomassie Brilliant Blue en bromophenol blue zijn twee verschillende kleurstoffen met een geheel andere functie in het SDS-PAGE-proces.
Bromophenol blue is een kleine, negatief geladen indicatorkleurstof die aan het laadmonster (sample buffer) wordt toegevoegd. Tijdens elektroforese migreert bromophenol blue snel door de gel als loopfront-markering: zodra het blauw-groene front de gelrand bereikt, stopt de elektroforese. De kleurstof detecteert zelf geen eiwitten.
Coomassie Brilliant Blue wordt pas na de elektroforese toegepast om de gescheiden eiwitbanden zichtbaar te maken. De kleurstof bindt specifiek aan eiwitten en geeft donkerblauwe banden op een heldere achtergrond na ontkleuring.
De verwarring ontstaat doordat beide kleurstoffen blauw zijn en beide in hetzelfde experiment worden gebruikt — maar op een ander moment en voor een andere doelstelling. Bromophenol blue wordt vóór en tijdens de run toegevoegd en hoort bij de monstervoorbereiding; Coomassie komt erna, als kleurstap. Na ontkleuring is bromophenol blue niet meer zichtbaar in de gel.
Voor het uitvoeren van gelkleuringen levert Labvakhandel chemicaliën, apparatuur voor moleculaire biologie, chromatografie- en bio-verbruiksmaterialen en handbescherming — snel leverbaar. Neem contact op voor advies bij de samenstelling van uw kleuringsprotocol.
Disclaimer: De informatie in dit artikel is bedoeld als algemene technische toelichting. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl aanvaardt geen aansprakelijkheid voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische, klinische of industriële situaties. Raadpleeg voor uw eigen toepassing altijd de geldende normen, vakliteratuur en de documentatie van fabrikant en apparatuur.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
