Een interne standaard is een bekende, niet in het monster aanwezige verbinding die in vaste hoeveelheid aan elk monster en elke kalibratieoplossing wordt toegevoegd, waarna de kwantificering plaatsvindt via de responsverhouding analyt/interne standaard in plaats van de absolute piekoppervlakte van de analyt zelf. Op die manier corrigeert de methode automatisch voor variaties die zich buiten de eigenlijke scheiding voordoen: verschillen in injectievolume, kleine verliezen tijdens monstervoorbereiding, drift van de detector, veranderingen in ionisatie-efficiëntie en extractie-recovery. De techniek is de facto standaard in gaschromatografie (GC), LC-MS en LC-MS/MS en ICP-MS en ICP-OES en wordt daar met verschillende materialen en principes ingevuld — van chemisch verwante moleculen tot stabiel-isotoop-gelabelde analogonen en elementen die in het monster ontbreken.
Bij externe standaardkalibratie wordt de analyt gekwantificeerd door de absolute piekoppervlakte te vergelijken met een ijklijn. Fluctuaties in injectievolume, verliezen tijdens verdampen, druppelvorming in de spuit of temperatuurgevoeligheid van de detector veranderen die absolute piekoppervlakte direct — de gemeten waarde wijkt dan af van de werkelijke concentratie zonder dat de analist het meteen ziet. Bij een interne standaard ondergaan analyt en IS dezelfde variatie: als 5 % minder monster wordt geïnjecteerd, dalen beide pieken met 5 % en blijft de verhouding gelijk. De rekenregel luidt:
Canalyt = (Aanalyt / AIS) × RF × CIS
waarin A de piekoppervlakte is en RF de responsfactor, bepaald uit de kalibratieoplossingen. Een aparte ijklijn wordt gemaakt door voor elk kalibratieniveau (Aanalyt/AIS) uit te zetten tegen (Canalyt/CIS). Het onderscheppingspunt is idealiter nul en de helling geeft de gemiddelde responsfactor. Bij correcte keuze van de IS wordt de meetonzekerheid substantieel gereduceerd; RSD-waarden onder 1 % zijn haalbaar in gevalideerde chromatografische methoden.
Een verbinding kan alleen als interne standaard fungeren wanneer zij chemisch stabiel is in de monstermatrix, niet reeds aanwezig is in het monster, in bekende zuiverheid en concentratie verkrijgbaar is, en analytisch onderscheidbaar (opgelost) is van de doelanalyt. Daarnaast moet de IS in het lineaire werkgebied van de detector vallen. Voor chromatografische scheidingen gelden zes praktische selectiecriteria:
De praktijk kent vier hoofdtypen, elk met een specifiek toepassingsgebied.
De klassieke keuze in GC en klassieke HPLC. Voor de bepaling van cafeïne wordt bijvoorbeeld theobromine gebruikt; voor benzoëzuur in dranken kaneelzuur; voor korte-keten vluchtige verbindingen 1-chlooroctaan of adamantaan. Beschikbaar tegen relatief lage kosten, maar corrigeert niet volledig voor matrixeffecten in massaspectrometrie omdat het chemische gedrag alsnog subtiel verschilt van de analyt.
De gouden standaard in LC-MS/MS-bioanalyse. Deuterium (D of ²H) en 13C zijn de meest gebruikte isotopen; voor stikstofhoudende verbindingen ook 15N. De gelabelde variant heeft dezelfde chemische structuur als de analyt en volgt haar door de volledige monstervoorbereiding, chromatografie en ionisatie. Alleen de massa verschilt — typisch met 3 tot 6 u — zodat de massaspectrometer analyt en IS afzonderlijk detecteert.
Deuterium-gelabelde standaarden zijn goedkoper maar hebben twee nadelen: bij omgekeerde-fase-scheiding kan een klein retentietijdverschil optreden (deuterium-isotoopeffect, meestal < 0,05 min) en H/D-uitwisseling in protische oplosmiddelen kan het label geleidelijk verliezen. 13C-gelabelde standaarden vertonen deze effecten niet en zijn de eerste keuze wanneer de hoogste analytische betrouwbaarheid vereist is, bijvoorbeeld bij klinische bioanalyse en registratiedossiers.
Een surrogaat is een verbinding die de gehele analytische keten volgt, inclusief extractie en derivatisering, en die wordt gebruikt om de recovery van die stappen te controleren. In milieu-analyse van bijvoorbeeld PAK's in bodem of sediment worden gedeutereerde PAK's als surrogaat toegevoegd vóór de extractie; de eindmeting van de surrogaat-recovery valideert de monstervoorbereiding zelf. Een surrogaat is dus een IS die vóór in plaats van na de monsterbehandeling wordt gespiket.
In ICP-MS en ICP-OES is de IS geen structuuranaloog maar een element dat in het monster niet aanwezig is en dat qua ionisatiepotentiaal, massa en gedrag in het plasma vergelijkbaar is met de analytelementen. Typische keuzes zijn Sc (voor lichte elementen), Rh en In (voor het middenmasse-gebied) en Re, Ir of Bi (voor zware elementen). De IS-oplossing wordt online via een T-stuk toegevoegd of vooraf aan alle standaarden en monsters, en corrigeert voor matrixgerelateerde signaalonderdrukking en drift van de nebulizer.
Drie kwantificeringsstrategieën staan de analytisch chemicus ter beschikking. Elk heeft eigen sterke punten en typische toepassingsgebieden.
De drie methoden zijn niet exclusief: een gevalideerde LC-MS/MS-methode combineert vaak een SIL-IS met matrix-matched kalibratoren, en ICP-methoden combineren een interne standaard met semikwantitatieve controle via standaardadditie in nieuwe matrices. Zie ook het artikel over kalibratie en meetnauwkeurigheid voor een dieper overzicht van kalibratiestrategieën en meetonzekerheid.
In de gaschromatografie is de interne standaard de aangewezen route wanneer piekoppervlakteonzekerheid door injectievariatie de dominante foutbron is. Een handmatige split/splitless-injectie heeft typisch een injectie-RSD van 3—5 %; met een correct gedoseerde IS daalt de kwantificerings-RSD tot onder 1 %. De IS wordt vóór de injectie aan het opgeloste monster toegevoegd in het injectievial — niet aan het onbewerkte monster, omdat verliezen tijdens extractie of headspace-preconcentratie de IS anders belasten dan de analyt.
Voor apolaire matrices (BTEX, opgeloste minerale oliën) zijn 1-chlooroctaan, adamantaan en toluene-d8 gangbare interne standaarden. Voor polaire GC (methylesters, alcoholen) worden korte-keten alkanen of gedeutereerde analoga toegepast. Bij GC-MS met SIM- of MRM-detectie zijn deuterium- of 13C-gelabelde standaarden vereist voor betrouwbare kwantificering van sporenverbindingen.
De IS wordt op vaste concentratie aan het opgeloste monster toegevoegd; wanneer de spuit iets meer of minder injecteert, verandert de absolute piekoppervlakte van zowel analyt als IS met dezelfde fractie. De verhouding blijft dan constant en het volumevariatie-effect valt weg. Bij automatische autosamplers is de injectie-RSD doorgaans al onder 1 %, maar handmatige splitless-injecties profiteren aanzienlijk meer.
In LC-MS en LC-MS/MS is de interne standaard onmisbaar omdat de electrospray-ionisatie sterk matrixafhankelijk is. Co-eluerende zouten, fosfolipiden of eiwitten veroorzaken ion suppression — het analytsignaal daalt zonder dat de analytconcentratie verandert. Alleen een stabiel-isotoop-gelabelde interne standaard (SIL-IS) die precies met de analyt co-eluert, ondergaat exact dezelfde ionisatieonderdrukking en compenseert het effect volledig. Dit maakt SIL-IS de standaard in klinische bioanalyse (plasma, urine, speeksel), farmacokinetiek en dopingcontrole.
Concentraties liggen typisch in dezelfde grootteorde als de verwachte analytconcentratie, of iets hoger; te veel IS onderdrukt zichzelf en te weinig maakt de piek onbetrouwbaar. Voor MRM-methoden worden voor analyt en IS afzonderlijke MRM-transities opgezet en wordt de responsverhouding per punt berekend. Bij omgekeerde-fase-HPLC en UHPLC wordt regelmatig een kleine deuterium-isotoop-shift waargenomen (typisch 0,01—0,05 min), die echter niet leidt tot afwijkende ionisatie zolang beide pieken binnen dezelfde matrixcoëluerende zone vallen.
Een isotoop-gelabelde interne standaard is een variant van de doelanalyt waarin een aantal atomen is vervangen door hun stabiele zwaardere isotoop — meestal 2H (deuterium), 13C of 15N. De chemische structuur en het chromatografisch gedrag zijn nagenoeg identiek, maar de molmassa verschilt voldoende (doorgaans 3—6 u) om in de massaspectrometer afzonderlijk te worden gedetecteerd. Deze standaarden compenseren voor variaties in injectie, extractie, ionisatie én matrixinterferentie in één stap.
Alleen een SIL-IS die precies met de analyt co-eluert compenseert volledig voor matrixeffecten in de ionenbron. Een structuuranaloog eluert bijna nooit exact op hetzelfde tijdstip als de analyt en ondergaat daarom een andere ionisatieonderdrukking; de correctie is dan slechts partieel. Bij ontbreken van een SIL-IS blijft matrix-matched kalibratie of standaardadditie noodzakelijk.
In ICP-MS en ICP-OES corrigeert de interne standaard voor drift van de nebulizer, veranderingen in het monstertransport en matrixgerelateerde signaalonderdrukking door hoge zoutgehalten. De IS bestaat hier uit één of meerdere elementen die in het monster niet voorkomen, in bekende concentratie aan alle standaarden en monsters toegevoegd (typisch 5—20 µg/L). Aanbevolen keuzes hangen af van de massa van de analyt: Sc (m/z 45) voor lichte elementen, Y (89) en In (115) voor het middenmassebereik, Tb (159), Re (187) en Bi (209) voor zware elementen. De ionisatiepotentiaal van de IS ligt idealiter dicht bij die van de analyt.
De correctie wordt uitgevoerd volgens:
Signaalgecorrigeerd = Signaalanalyt × (SignaalIS, standaard / SignaalIS, monster)
Voor ICP-emissiemeting voor wateranalyse geldt dat de interne standaard in dezelfde zuurmatrix (typisch 2—5 % HNO3) wordt aangeboden als de monsters. Bij hoge opgeloste-vasteweefsels (zeewater, urine) wordt vaak online-verdunning gecombineerd met een IS om zowel drift als transportvariatie te ondervangen.
Kies een element dat niet in het monster voorkomt, monoisotopisch of met een ongebruikte isotoop is te meten, dezelfde grootteorde van massa heeft als de doelanalyt en een vergelijkbare ionisatiepotentiaal. Rh en In zijn universele middenmasse-standaarden, Sc dekt lage massa's en Bi of Re de hoge. Voor complexe matrices worden meerdere IS-elementen tegelijk toegevoegd, zodat elk analytmassabereik zijn eigen correctie krijgt.
De IS-stockoplossing wordt bereid in een oplosmiddel waarin de IS chemisch stabiel is en dat mengbaar is met de kalibratoren en monsters. Voor GC zijn methanol, aceton en hexaan gangbaar; voor LC-MS methanol/water, acetonitril of DMSO; voor ICP een verdunde zuuroplossing (HNO3 of HCl). De concentratie wordt zo gekozen dat na dosering de eindpiek in het lineaire werkgebied van de detector valt en vergelijkbaar is met de gemiddelde analytpiek.
Bij een volumetrische dosering van een vaste hoeveelheid IS-oplossing aan elke buis is de dosernauwkeurigheid rechtstreeks bepalend voor de kwantificeringsprecisie. Gebruik daarom een gekalibreerde variabele-volume of vast-volume pipet, of een gecontroleerde pipetteertechniek die aantoonbaar binnen de vereiste marge werkt. Voor monsters die worden verdampt, gederivatiseerd of geëxtraheerd wordt de IS meestal vóór die stap toegevoegd (als surrogaat), zodat verliezen worden mee-gecorrigeerd.
De hoeveelheid moet zo worden gekozen dat de IS-piek qua respons vergelijkbaar is met de te verwachten analytpiek in het midden van het werkgebied — typisch tussen 50 en 200 % van de verwachte analytresponse. Te lage concentraties leveren onbetrouwbare piekintegratie, te hoge kunnen zelfsuppression, matrix-overload of detectorverzadiging veroorzaken. Bij MS-detectie is de gangbare vuistregel: dezelfde grootteorde als de mid-kalibratieconcentratie.
De acht meest voorkomende problemen bij toepassing van een interne standaard, en de bijpassende oplossingsroute:
Bij methoden die met een interne standaard worden gekwantificeerd, worden de ICH Q2-validatieparameters berekend uit de response ratio Aanalyt/AIS in plaats van uit de absolute Aanalyt. Nauwkeurigheid en precisie worden dan aantoonbaar beter, met name in complexe matrices. Voor de lineariteit geldt dat de kalibratielijn wordt opgesteld als functie van Canalyt/CIS versus Aanalyt/AIS; R² ≥ 0,999 is de gangbare acceptatie voor farmaceutische toepassingen. Voor de recovery wordt de spike-methode toegepast: de IS wordt vóór spike toegevoegd, waarna de gemeten recovery de volledige monstervoorbereidingsverliezen weergeeft. Voor de robuustheid wordt getoetst of kleine variaties in de IS-doseringsvolume (±10 %) geen significant effect hebben op de eindconcentratie — als dat wel het geval is, is de IS-dosering een kritische parameter en moet die worden opgenomen in de systeemgeschiktheidscriteria.
Voor de normatieve achtergrond over methodevalidatie in de farmaceutische sector verwijzen wij naar de ICH-kwaliteitsrichtlijnen (ICH Q2 en Q14) en, voor Nederlandse vertaalde normen, naar NEN.
In qNMR wordt absolute kwantificering uitgevoerd door de integraal van de analyt-piek te vergelijken met de integraal van een bekende hoeveelheid interne standaard. Klassieke keuzes zijn dimethylsulfon, maleïnezuur of 1,4-dinitrobenzeen — verbindingen met een gedefinieerd aantal equivalente protonen en hoge zuiverheid. qNMR met interne standaard levert gehaltebepalingen met een onzekerheid van 0,5—1,0 % en wordt door de Ph.Eur. erkend als alternatief voor HPLC voor primaire standaardisatie.
In Karl Fischer-titratie wordt vaak een bekende hoeveelheid water toegevoegd als interne controle op de titerbepaling. In ionenchromatografie wordt bromide of lithium regelmatig ingezet als interne standaard voor anionen respectievelijk kationen.
In capillaire elektroforese corrigeert een interne standaard voor variaties in injectievolume en veranderingen in elektro-osmotische flow (EOF). Voor eiwitanalyse in 2D-DIGE dient een pool van alle monsters, gelabeld met Cy2, als interne standaard voor normalisatie tussen gels.
Een interne standaard corrigeert automatisch voor variaties die zich buiten de scheiding voordoen — verschillen in injectievolume, extractie-recovery, ionisatie-efficiëntie en detector-drift. Doordat de kwantificering plaatsvindt via de verhouding analyt/IS, ondergaan beide componenten dezelfde variatie en valt die weg in de ratio. Het gevolg is een lagere meetonzekerheid en een RSD die typisch onder 1 % ligt in gevalideerde methoden.
Bij externe standaardkalibratie wordt de analyt gekwantificeerd via een ijklijn van absolute piekoppervlakten. Variaties in injectie of detectorrespons vertalen zich direct in de gemeten concentratie. Bij interne standaardkalibratie wordt een bekende hoeveelheid IS aan elk monster en elke standaard toegevoegd; de kwantificering vindt plaats via de piekoppervlakteverhouding, waarmee die variaties worden gecompenseerd. Externe standaardisatie is eenvoudiger; interne is nauwkeuriger in complexe matrices en bij spoorbepalingen.
Nee. De IS moet chemisch stabiel zijn in de matrix, niet in het monster voorkomen, in bekende zuiverheid en concentratie verkrijgbaar zijn, chromatografisch onderscheidbaar zijn van de analyt en binnen het lineaire werkgebied van de detector detecteerbaar zijn. Voor MS-detectie moet de massa afwijken van die van de analyt en van in-source-fragmenten.
Standaardadditie is de aangewezen route wanneer geen geschikte IS beschikbaar is — typisch bij nieuwe matrices, ongebruikelijke analyten of wanneer de matrix zo variabel is dat de IS-respons zelf niet stabiel is. Standaardadditie compenseert wel de matrixeffecten binnen dat ene monster, maar is arbeidsintensief en brengt extrapolatie-onzekerheid mee. Voor routinemetingen prevaleert de IS-methode.
De responsfactor (RF) is de verhouding waarmee de detectorresponse van de analyt afwijkt van die van de interne standaard bij gelijke concentratie. RF = (Aanalyt/AIS) ÷ (Canalyt/CIS). RF wordt bepaald uit een kalibratieoplossing waarin de concentraties van analyt en IS bekend zijn en constant blijft binnen het lineaire werkgebied. Bij een goed gekozen IS ligt RF dicht bij 1, wat de kwantificering ongevoelig maakt voor verschillen in detectorgevoeligheid.
Een surrogaat is een bijzonder type interne standaard dat vóór de monstervoorbereiding wordt toegevoegd, waardoor het de recovery van extractie, derivatisering en concentrering meecorrigeert. Een gewone interne standaard wordt pas na de monstervoorbereiding gedoseerd (net vóór injectie) en corrigeert alleen voor injectie- en detectorvariatie. In sommige methoden worden beide gebruikt: een surrogaat voor de recovery-check en een tweede IS vlak vóór injectie voor de kwantificering.
Een SIL-IS is een analoge verbinding waarin een deel van de atomen is vervangen door hun stabiele zwaardere isotoop — meestal deuterium (2H), 13C of 15N. Chemisch gedrag en chromatografische elutie zijn vrijwel identiek aan die van de analyt; alleen de massa verschilt voldoende voor massaspectrometrische discriminatie. SIL-IS is de gouden standaard voor kwantitatieve LC-MS/MS-bioanalyse omdat het compenseert voor alle bronnen van variatie in één keer, inclusief matrixgerelateerde ionisatieonderdrukking.
Gedeeltelijk. Een structuuranaloge IS compenseert voor injectie- en detectorvariatie maar niet volledig voor matrixgerelateerde ionisatieonderdrukking in ESI, omdat de IS bijna nooit exact met de analyt co-eluert. Alleen een SIL-IS die precies co-eluert ondergaat dezelfde ionisatieonderdrukking en compenseert het matrixeffect volledig. Voor matrices waarin geen SIL-IS beschikbaar is, blijven matrix-matched kalibratie of standaardadditie noodzakelijk.
De IS-concentratie wordt zo gekozen dat de IS-piek qua respons binnen 50—200 % van de te verwachten analytpiek in het midden van het werkgebied valt. Bij MS-detectie geldt: dezelfde grootteorde als het midden van de kalibratiereeks. Te lage doseringen leveren onbetrouwbare integratie; te hoge kunnen zelfsuppression of detectorverzadiging veroorzaken.
Bij LC-MS beïnvloeden matrixcomponenten de electrospray-ionisatie sterk (ion suppression). Alleen een SIL-IS die precies met de analyt co-eluert ondergaat identiek dezelfde ionisatieonderdrukking en compenseert het effect volledig. Een structuuranaloog eluert bijna altijd op een iets andere retentietijd en corrigeert dus slechts gedeeltelijk. Dit maakt SIL-IS onmisbaar voor betrouwbare kwantificering van sporenanalyten in plasma, urine en voedsel.
Sc voor lichte elementen (m/z 20—60), Y of Rh voor het middenmassebereik (60—120), In als universele mid-massa-IS, Tb voor lanthaniden en Re, Ir of Bi voor zware elementen (m/z > 150). De IS wordt gekozen op basis van masse-afstand en overeenkomende ionisatiepotentiaal, en toegevoegd in een concentratie van typisch 5—20 µg/L in dezelfde zuurmatrix als de monsters.
De relatieve responsfactor is de verhouding van de responsfactor van een verbinding tot die van een interne standaard, en wordt gebruikt in farmaceutische onzuiverheidsanalyse om gehalten te berekenen zonder aparte kalibratielijn per onzuiverheid. De RRF wordt eenmalig experimenteel bepaald en in de methode gedocumenteerd; de onzuiverheid wordt dan berekend als (Aonzuiverheid ÷ RRF) ÷ Ahoofdcomponent × concentratie hoofdcomponent.
Voor verdieping in gerelateerde onderwerpen zijn de volgende kennisbankartikelen relevant: kalibratie en meetnauwkeurigheid voor een breder overzicht van kalibratiestrategieën en meetonzekerheid, validatie van analytische methoden (ICH Q2) voor validatievereisten, primaire standaarden in de analytische chemie voor referentiematerialen en traceerbaarheid, solid-phase extraction (SPE) voor monstervoorbereiding met surrogaat-standaarden, en massaspectrometrie voor de detectie-achtergrond bij SIL-IS-toepassingen.
Voor de bereiding en dosering van interne standaardoplossingen levert Labvakhandel gecertificeerd maatglaswerk klasse A, autosampler vials en flacons, pipetten en micropipetten voor nauwkeurige dosering en laboratoriumchemicaliën in analytische zuiverheidsgraden. Neem contact op voor advies over de juiste materialen voor uw methode.
Disclaimer: De informatie in dit artikel is bedoeld als algemene technische toelichting. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl aanvaardt geen aansprakelijkheid voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische, klinische of industriële situaties. Raadpleeg voor uw eigen toepassing altijd de geldende normen, vakliteratuur en de documentatie van fabrikant en apparatuur.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
