De retentietijd is de tijd tussen het injecteren van een monster en het piekmaximum van een stof in het chromatogram. Het is het getal waarmee u in gas- en vloeistofchromatografie een stof herkent, en het is de basis voor bijna elk ander kencijfer van een scheiding: dode tijd, retentiefactor, selectiviteit, schotelgetal en resolutie. De technieken zelf worden behandeld in Gaschromatografie (GC) en HPLC — hogedruk vloeistofchromatografie. Dit artikel gaat over het getal zelf: hoe u het berekent, waarvan het afhangt, waarom het verschuift en wat u er wel en niet mee kunt aantonen.
Retentietijd (symbool tR) is de verblijftijd van een stof in het chromatografische systeem: de tijd vanaf de injectie tot het moment waarop het piekmaximum de detector bereikt. Bij een stof die sterk wordt vastgehouden door de stationaire fase is de retentietijd lang; een stof die vooral in de mobiele fase blijft, komt snel door. De retentietijd wordt meestal in minuten gegeven en uit het chromatogram afgelezen, tegenwoordig door de dataverwerkingssoftware.
In de scheikunde is de retentietijd de tijd die een stof nodig heeft om door een chromatografische kolom te gaan, gemeten van injectie tot piekmaximum. Onder vaste omstandigheden (kolom, mobiele fase, temperatuur, stroomsnelheid) is die tijd karakteristiek voor de stof en wordt hij gebruikt om de stof te herkennen. Bij dunnelaagchromatografie en papierchromatografie meet men geen tijd maar een afstand: daar neemt de Rf-waarde de plaats van de retentietijd in.
‘Retentie tijd’ en ‘retentietijd’ zijn dezelfde term, in de chromatografie de verblijftijd van een stof in de kolom. Het woord retentie betekent op andere plaatsen iets anders: bij filtreerpapier is het het vermogen om deeltjes van een bepaalde grootte tegen te houden, zie filterpapier en weegpapier. In de waterzuivering en bij reactoren is de hydraulische verblijftijd het volume gedeeld door het debiet. Die betekenissen vallen buiten dit artikel.
Chromatografie berust op het verschil in verdeling van stoffen tussen twee fasen: een stationaire fase die in de kolom of op de plaat blijft zitten, en een mobiele fase die erdoorheen stroomt. Elke stof heeft een eigen affiniteit voor beide fasen. Een stof die veel tijd in de mobiele fase doorbrengt, wordt snel meegevoerd; een stof die vaak aan de stationaire fase bindt, loopt achter. Door dat verschil in snelheid komen de stoffen op verschillende momenten bij de detector aan. Dat tijdsverschil is de retentietijd.
Het monster wordt aan het begin van het systeem aangebracht (geïnjecteerd of gespot) en door de mobiele fase meegevoerd langs de stationaire fase. Onderweg verdelen de stoffen zich telkens opnieuw tussen beide fasen. Doordat die verdeling per stof verschilt, scheiden de stoffen zich in banden of pieken. Een detector registreert wat eruit komt, en het resultaat is een chromatogram.
De stationaire fase blijft op zijn plaats: een vaste stof of een op een drager gebonden vloeistof, zoals silica, een gebonden C18-fase of een vloeibare film in een GC-kolom. De mobiele fase beweegt: een gas bij gaschromatografie, een vloeistof bij HPLC en TLC. De stoffen bewegen met de mobiele fase mee en worden door de stationaire fase afgeremd.
De stationaire fase is het materiaal waaraan de stoffen tijdelijk binden of waarin ze zich oplossen. Het kan een poreuze vaste stof zijn (silicagel, aluminiumoxide), een gebonden fase op silica (C18, C8), een vloeistoffilm op de wand van een capillaire GC-kolom, of bij papierchromatografie het water dat aan cellulosevezels is gebonden. De keuze van de stationaire fase bepaalt het meest van alles hoe sterk een stof wordt vastgehouden.
Het bekendste voorbeeld uit het onderwijs is papierchromatografie van bladpigmenten of inkt, waarbij kleurstoffen zich over een stuk papier verspreiden. In het laboratorium wordt GC gebruikt om vluchtige stoffen zoals oplosmiddelen te scheiden en te bepalen, HPLC voor het gehalte aan werkzame stoffen en onzuiverheden, en ionenchromatografie voor anionen in water; zie ionenchromatografie van anionen in water. Dunnelaagchromatografie wordt gebruikt voor een snelle controle van een reactie.
Een chromatogram is de grafiek van het detectorsignaal tegen de tijd. Elke stof geeft een piek, en in de piek zit vierlei informatie:
Hoe u een chromatogram stap voor stap afleest, staat in HPLC — hogedruk vloeistofchromatografie en Gaschromatografie (GC).
De retentietijd staat nooit alleen. Bij elke scheiding hoort een vaste set grootheden die u uit het chromatogram afleidt. De tabel geeft ze met de formule en de betekenis.
De dode tijd (t₀, ook void time) is de tijd die een stof nodig heeft die helemaal niet door de stationaire fase wordt vastgehouden. In GC gebruikt men daarvoor methaan bij een FID of lucht bij een warmtegeleidingsdetector. In omgekeerde-fase-HPLC wordt vaak een stof als uracil of thioureum gebruikt; het solventfront is een minder nauwkeurige benadering. Zonder correcte t₀ zijn de gecorrigeerde retentietijd en de retentiefactor niet te berekenen.
De retentiefactor k (ook capaciteitsfactor k′) geeft aan hoeveel langer een stof in de stationaire fase verblijft dan in de mobiele fase: k = (tR − t₀) / t₀. In tegenstelling tot de retentietijd hangt k niet af van de kolomlengte of de stroomsnelheid, en is daarom beter om methoden en kolommen te vergelijken. Een k tussen 2 en 10 wordt voor de meeste scheidingen als goed beschouwd: lager dan 1 is te dicht bij de dode tijd, boven 20 wordt de analyse onnodig lang en worden de pieken breed.
Neem een chromatogram met een niet-retinerende piek op t₀ = 1,00 min en twee pieken A en B. De waarden in de tabel zijn voorbeeldwaarden om de berekening te laten zien.
Rs ≥ 1,5 wordt als basislijnscheiding beschouwd. Met Rs = 2,35 zijn de pieken in dit voorbeeld ruim gescheiden.
De Rf-waarde is de tegenhanger van de retentietijd bij dunnelaagchromatografie en papierchromatografie. Daar meet u geen tijd maar de afstand die een vlek heeft afgelegd, ten opzichte van de afstand van het oplosmiddelfront.
Rf = afstand van de startlijn tot het midden van de vlek / afstand van de startlijn tot het oplosmiddelfront. Beide afstanden meet u vanaf dezelfde startlijn en in dezelfde eenheid, zodat de Rf-waarde een getal zonder eenheid is tussen 0 en 1. Een vlek die 3,0 cm is gelopen terwijl het front 6,0 cm is gelopen, heeft Rf = 0,50.
De Rf-waarde zegt hoe sterk een stof door de stationaire fase wordt vastgehouden. Een lage Rf betekent veel binding aan de stationaire fase, een hoge Rf betekent dat de stof vooral met de mobiele fase meebeweegt. Onder vaste omstandigheden (plaat, eluens, verzadiging van de loopkamer, temperatuur) is de Rf-waarde karakteristiek, maar twee stoffen met dezelfde Rf zijn niet per definitie identiek. Meer hierover vindt u in Dunnelaagchromatografie (TLC) en Papierchromatografie; het practicum over Rf-waarden laat het zelf bepalen zien.
Voor een ideale scheiding geldt Rf = 1 / (1 + k), en omgekeerd k = (1 − Rf) / Rf. In het rekenvoorbeeld heeft piek A met k = 4,00 dus een Rf-equivalent van 1 / 5,00 = 0,20, ofwel t₀ / tR. Daarmee is een Rf van 0,2 tot 0,3, de streefwaarde voor een stof op de TLC-plaat voor een kolomscheiding, vergelijkbaar met een k van ruwweg 2,3 tot 4.
Dunnelaagchromatografie (TLC) is een chromatografische techniek waarbij een dunne laag stationaire fase, meestal silicagel op een glas-, aluminium- of kunststofplaat, wordt gebruikt. Het monster wordt als vlek aangebracht en de plaat staat in een loopkamer met een eluens dat door capillaire werking omhoog trekt. TLC is snel en goedkoop en wordt gebruikt voor het volgen van reacties en voor een snelle identiteitscontrole. Zie Dunnelaagchromatografie (TLC).
Chromatografiepapier is een speciaal papier van zuivere cellulose met een gelijkmatige dikte en een goede capillaire werking, bedoeld als drager bij papierchromatografie. De eigenlijke stationaire fase is het water dat aan de cellulosevezels is gebonden. Zie Papierchromatografie.
Het schotelgetal (N, ook plaatgetal of aantal theoretische platen) is de maat voor de efficiëntie van een kolom. Het idee komt uit de schotelentheorie die Martin en Synge in de jaren 1940 voor chromatografie ontwikkelden, naar analogie met een destillatiekolom: hoe meer theoretische schotels waar zich telkens een evenwicht tussen beide fasen instelt, hoe smaller de pieken en hoe beter de scheiding. Martin en Synge kregen in 1952 de Nobelprijs voor de Scheikunde voor hun werk aan de verdelingschromatografie.
In de praktijk berekent u N uit het chromatogram. Er zijn twee gangbare formules, en de uitkomst is alleen te vergelijken als u dezelfde formule gebruikt:
Een hoger schotelgetal betekent smallere pieken en een betere scheiding bij dezelfde retentie. De acceptatiecriteria voor N in een system suitability test, volgens de Ph. Eur. en de USP, staan in System Suitability Test (SST).
De schotelhoogte (HETP of H) is de kolomlengte per theoretische schotel: H = L / N. Een kleinere H betekent een efficiëntere kolom. Bij een kolom van 150 mm en N = 6400 is H ongeveer 23 micrometer. Kleinere deeltjes en core-shell-deeltjes geven een lagere H; zie core-shell-deeltjes (SPP) en UHPLC.
De fundamentele resolutievergelijking verbindt de drie: Rs = (√N / 4) · ((α − 1) / α) · (k / (1 + k)). Het schotelgetal N bepaalt hoe smal de pieken zijn, de selectiviteit α hoe ver de pieken uit elkaar liggen en de retentiefactor k hoeveel retentie er is. Winst op N levert maar langzaam resolutie op, want de resolutie groeit met de wortel van N; verdubbeling van de kolomlengte geeft ongeveer 40 procent meer resolutie. Een kleine winst in α is vaak effectiever. Daarom richt methode-ontwikkeling zich eerst op de selectiviteit, bijvoorbeeld door de mobiele fase of de stationaire fase te wijzigen.
De retentietijd is geen constante van een stof, maar een eigenschap van stof én systeem. De tabel geeft de belangrijkste invloeden.
De vuistregels in de tabel gelden voor de meeste stoffen maar niet voor alle; het exacte effect hangt van de stof en het systeem af. Voor het verloop bij gradiëntelutie, waar de samenstelling tijdens de run verandert, zie gradiënt-elutie bij HPLC.
Kijk eerst naar het patroon. Verschuift alleen de retentietijd van de analyten, of ook t₀? De tabel helpt bij de eerste diagnose.
Meer over matrixinvloeden leest u in matrixeffecten. Of een kleine verschuiving de methode nog bruikbaar laat, hangt af van de robuustheid; zie robuustheid van analytische methoden.
Het vergelijken van de retentietijd met die van een referentiestandaard onder identieke omstandigheden is de basis van identificatie in GC en HPLC. De beperking is dat twee verschillende stoffen toevallig dezelfde retentietijd kunnen hebben, zodat de retentietijd een aanwijzing is en geen bewijs.
Nee, niet op zichzelf. Dezelfde retentietijd past bij een stof, maar sluit niet uit dat een andere stof ook zo elueert. Voor een betrouwbaarder identificatie voegt u een tweede onafhankelijk gegeven toe: een UV-spectrum met een diode-array-detector (diode-array detectie), een massaspectrum via LC-MS en LC-MS/MS of massaspectrometrie, of een spike met de standaard (co-injectie), waarbij de piek niet mag splitsen.
De relatieve retentietijd (RRT) is de retentietijd van een stof gedeeld door die van een referentiestof, zoals de hoofdcomponent of een interne standaard. Omdat veel invloeden beide pieken in dezelfde mate verschuiven, is de RRT stabieler dan de absolute tR. Hij wordt veel gebruikt voor onzuiverheden in de farmaceutische analyse. Over interne standaarden leest u meer in de interne standaard bij kwantitatieve analyse.
De Kováts-retentie-index is een manier om de retentie in gaschromatografie uit te drukken ten opzichte van een reeks n-alkanen, die per definitie de index 100 maal het aantal koolstofatomen krijgen (n-octaan 800, n-nonaan 900). Een stof die tussen twee alkanen elueert, krijgt een tussenliggende waarde. Bij isotherm werken is de formule I = 100 · [n + (log t′R(x) − log t′R(n)) / (log t′R(n+1) − log t′R(n))], met n het alkaan dat vlak vóór de stof elueert. Bij temperatuurprogrammering wordt een lineaire variant met tR gebruikt. Omdat de index minder afhangt van kolomlengte en stroomsnelheid dan de retentietijd, is hij beter te vergelijken tussen laboratoria.
In een gevalideerde methode legt u vast hoeveel de retentietijd van de analyt mag afwijken van die van de standaard in dezelfde reeks. Dat venster stelt u op uit de gemeten spreiding en de robuustheid van de methode, en u past het niet achteraf aan om een afwijkende piek toch te accepteren. Controleer de retentietijd in elke reeks met een standaard en volg de verschuiving over de tijd. Hoe dat past in de dagelijkse controle, staat in validatie van analytische methoden.
De keuze tussen normale en omgekeerde fase bepaalt in welke volgorde stoffen elueren. Dat is bij het interpreteren van retentietijden een eerste vraag.
Bij normale fase chromatografie is de stationaire fase polair, meestal silicagel, en de mobiele fase apolair. Polaire stoffen worden sterk vastgehouden en elueren laat, apolaire stoffen elueren snel. Dunnelaagchromatografie op silicagel en klassieke kolomchromatografie werken meestal in normale fase. De omgekeerde situatie is de standaard in HPLC; zie omgekeerde-fase-HPLC. Voor zeer polaire stoffen bestaat daarnaast HILIC, en voor een grotere preparatieve schaal klassieke kolomchromatografie.
De retentietijd speelt in beide technieken dezelfde rol, maar de factoren die hem bepalen verschillen. Hieronder het basisoverzicht voor wie de afkortingen zoekt.
GC staat voor gaschromatografie: chromatografie met een gas als mobiele fase. De techniek is geschikt voor stoffen die ongeschonden kunnen verdampen, zoals oplosmiddelen, geurstoffen en vluchtige onzuiverheden. Zie Gaschromatografie (GC).
Een kleine hoeveelheid monster wordt in een verwarmde injector verdampt en door het dragergas in een capillaire kolom in een oven gevoerd. Stoffen verdelen zich tussen het gas en de vloeibare film op de kolomwand. Stoffen met een laag kookpunt en weinig affiniteit voor de film komen het eerst, en een detector zoals een FID registreert elke stof als piek. Door de oventemperatuur te programmeren worden ook stoffen met een hoog kookpunt in redelijke tijd geëlueerd.
Beschouw gaschromatografie als een wedstrijd door een smalle buis: alle stoffen starten tegelijk, maar de stof die het minst blijft plakken, wint. Het gas draagt ze mee, de wand houdt ze vast, en de volgorde van aankomst plus de tijd per stof geeft de informatie. Een uitgebreide toelichting vindt u in Gaschromatografie (GC), en bij vluchtige stoffen in vaste of vloeibare monsters ook in headspace-GC.
HPLC staat voor High Performance Liquid Chromatography, in het Nederlands hogeprestatie- of hogedrukvloeistofchromatografie. Beide vertalingen worden gebruikt; de eerste benadrukt de kwaliteit van de scheiding, de tweede de druk waarmee de mobiele fase door de kolom wordt geperst.
Bij HPLC pompt een pomp een vloeibare mobiele fase onder hoge druk door een met fijne deeltjes gepakte kolom. Het monster wordt vlak voor de kolom geïnjecteerd, en de stoffen worden gescheiden op basis van hun affiniteit voor de stationaire fase. Een detector, bijvoorbeeld UV, registreert de stoffen als pieken. HPLC is geschikt voor niet-vluchtige en thermisch labiele stoffen. Zie HPLC — hogedruk vloeistofchromatografie.
Een HPLC-kolom is een buis, meestal van roestvrij staal, gevuld met de stationaire fase in de vorm van fijne deeltjes, bijvoorbeeld op silica gebonden C18. Het type deeltje, de poriegrootte, de lengte en de binnendiameter bepalen de retentie en efficiëntie. De kolom is het onderdeel dat het meest bepaalt wat de retentietijd wordt; zie ook de onderdelen van het HPLC-systeem in HPLC — hogedruk vloeistofchromatografie.
Een retentietijd is pas bruikbaar als hij reproduceerbaar is. Dat vraagt om een paar vaste gewoonten:
Voor chromatografie vindt u bij Labvakhandel apparatuur in de webgroep chromatografie-apparatuur, verbruiksartikelen in chromatografie (laboratoriumplastics), monstervials in vials en flacons en filters voor monstervoorbereiding bij spuitfilters. Neem contact op voor advies bij de keuze van de juiste materialen.
Onderdeel van: Farmaceutisch laboratorium · Milieulaboratorium · Voedingslaboratorium
Geschreven door Labvakhandel, specialist in laboratoriumbenodigdheden voor bedrijven en instellingen.
Disclaimer: De informatie in dit artikel is bedoeld als algemene technische toelichting. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl aanvaardt geen aansprakelijkheid voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische, klinische of industriële situaties. Raadpleeg voor uw eigen toepassing altijd de geldende normen, vakliteratuur en de documentatie van fabrikant en apparatuur.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
