Het isoëlektrisch punt (pI) is een fysisch-chemische constante van elk molecuul dat protonen kan opnemen of afgeven — aminozuren, peptiden, eiwitten, sommige kleurstoffen en zelfs anorganische polymeren. Bij deze specifieke pH-waarde is de netto elektrische lading van het molecuul precies nul. Isoelektrische focusing (IEF) benut dit gegeven om moleculen — in de praktijk vooral eiwitten — met zeer hoge resolutie te scheiden op basis van hun pI. IEF is daarmee een van de meest selectieve scheidingstechnieken uit de biochemische toolbox en de logische eerste dimensie in 2D-PAGE, in capillaire elektroforese als CIEF en in de ladingvariantanalyse van monoklonale antilichamen.
Dit artikel behandelt eerst het pI-begrip zelf — hoe u het berekent uit pKa-waarden en welke factoren de waarde beïnvloeden. Vervolgens komen de werking van IEF, de opbouw en keuze van IPG-strips, het verschil met carrier-ampholieten en de praktische uitvoering in het laboratorium aan bod, met specifieke aandacht voor eiwitzuivering, biofarmaceutische ladingvariantanalyse en klinische toepassingen. Tot slot volgt een troubleshooting-sectie en een reeks veelgestelde vragen.
Het isoëlektrisch punt van een molecuul is de pH-waarde waarbij de som van alle positieve ladingen gelijk is aan de som van alle negatieve ladingen — de nettolading is dan nul. Voor eiwitten en peptiden ontstaat lading uit de zijketens van geladen aminozuren (aspartaat, glutamaat, lysine, arginine, histidine) en uit de eindstandige α-aminogroep en α-carboxylgroep. Elk van deze groepen heeft een eigen pKa-waarde die bepaalt bij welke pH de groep grotendeels geprotoneerd of gedeprotoneerd is.
Beneden het pI is een eiwit netto positief geladen: overtollige aminogroepen zijn geprotoneerd (–NH3+). Boven het pI is het eiwit netto negatief geladen: overtollige carboxylgroepen zijn gedeprotoneerd (–COO−). Op het pI zijn beide precies in evenwicht en gedraagt het eiwit zich als een zwitterion zonder netto lading. Deze eigenschap heeft twee praktische gevolgen: op het pI is het eiwit maximaal minder oplosbaar (de elektrostatische afstoting tussen moleculen valt weg, wat aggregatie of neerslag bevordert) én het eiwit reageert niet op een aangelegd elektrisch veld — het staat stil in een elektroforetische opstelling.
Het pI wordt bepaald door het totale aminozuurprofiel van het eiwit. Zelfs eiwitten met identieke molecuulmassa kunnen sterk verschillende pI-waarden hebben doordat de verhouding tussen zure (D, E) en basische (K, R, H) residuen verschilt. Bovendien is het effectieve pI van een gevouwen eiwit niet exact te berekenen uit de losse residu-pKa's: de driedimensionale structuur, waterstofbrugvorming en de dielektrische omgeving in de eiwitkern kunnen de effectieve pKa's van individuele zijketens met 1 tot 3 pH-eenheden verschuiven. Voor eiwitzuivering en stabiliteitsonderzoek is de experimenteel bepaalde pI daarom betrouwbaarder dan de voorspelde waarde.
Ruwweg 75 % van alle cellulaire eiwitten heeft een pI tussen 4 en 9. Zure eiwitten (pI < 6) domineren onder meer in het cytosol; basische eiwitten (pI > 8) zijn oververtegenwoordigd onder de nucleaire eiwitten (histonen hebben een pI van 10 tot 12) en membraaneiwitten. Extreme waarden komen voor: pepsine (pI ≈ 1) is een van de zuurste bekende eiwitten, terwijl protamine (pI ≈ 13) tot de meest basische behoort. Voor de meeste analytische toepassingen dekt een pH-gradient van 3 tot 10 het hele biologisch relevante bereik.
Voor een aminozuur zonder geladen zijketen (zoals alanine of glycine) is het pI het rekenkundig gemiddelde van de pKa van de α-carboxylgroep (typisch 2,3) en de pKa van de α-aminogroep (typisch 9,7):
pI = (pKaCOOH + pKaNH3+) / 2
Voor alanine geeft dat pI = (2,3 + 9,7) / 2 = 6,0. Voor aminozuren met een geladen zijketen wordt het pI berekend als het gemiddelde van de twee pKa-waarden die het zwitterion aan weerszijden begrenzen. Voor glutaminezuur (zuur, pKa-zijketen 4,25) is dat het gemiddelde van pKaCOOH en pKazijketen: pI = (2,19 + 4,25) / 2 = 3,22. Voor lysine (basisch, pKa-zijketen 10,53) is dat het gemiddelde van pKaNH3 en pKazijketen: pI = (8,95 + 10,53) / 2 = 9,74. Deze methodiek berust op de Henderson-Hasselbalch-vergelijking en op het uitgangspunt dat op het pI de netto lading precies nul is.
Voor een eiwit met tientallen tot honderden ioniseerbare residuen wordt de netto lading als functie van de pH numeriek berekend. Voor elk residu wordt de fractie geprotoneerd via Henderson-Hasselbalch bepaald, waarna alle bijdragen worden opgeteld. Het pI is de pH-waarde waar de totale netto lading gelijk is aan nul. Publieke tools zoals ExPASy ProtParam of Isoelectric Point Calculator gebruiken standaard pKa-tabellen (Bjellqvist, EMBOSS of DTASelect) en leveren voorspellingen die doorgaans binnen 0,5 pH-eenheid van de experimentele waarde liggen — voor gevouwen eiwitten in native buffer soms verder afwijkend door de eerdergenoemde microenvironmentseffecten.
Isoelektrische focusing is een elektroforetische scheidingstechniek waarbij amfotere moleculen (eiwitten, peptiden, ampholieten) in een stabiele pH-gradient onder invloed van een elektrisch veld migreren tot de omgevings-pH gelijk is aan hun pI. Op dat punt verliest het molecuul zijn netto lading en stopt het met bewegen. Het gevolg is dat alle eiwitten met dezelfde pI zich in een scherpe, smalle band focusseren op één positie in het scheidingsmedium — vandaar de naam.
Het onderscheid met conventionele gelelektroforese is fundamenteel: bij gewone elektroforese blijven eiwitten migreren zolang het veld aanstaat en wordt de scheiding bepaald door de tijd. Bij IEF is de scheiding steady-state: onafhankelijk van de tijd, en dus onafhankelijk van kleine variaties in migratieduur, komen eiwitten altijd op dezelfde pI-positie tot rust. Diffusie wordt actief tegengewerkt door de gradient zelf — een eiwit dat door diffusie iets afwijkt van zijn pI krijgt onmiddellijk weer lading en migreert terug. Dit "self-sharpening"-effect verklaart de uitzonderlijke resolutie van IEF: ΔpI-waarden van 0,01 pH-eenheid zijn onder optimale omstandigheden scheidbaar.
De theoretische onderbouwing komt van Harry Svensson (later Rilbe) in de jaren zestig, met Olof Vesterberg als synthetisch pionier van de eerste bruikbare carrier ampholieten in 1966. De doorbraak richting reproduceerbaarheid volgde in 1982 met de introductie van de immobilised pH gradient (IPG) door Bjellqvist, Görg en collega's, waarbij de gradient chemisch verankerd wordt in het polyacrylamide-netwerk. IPG-strips maakten IEF geschikt voor routinematige toepassing en zijn nu de dominante uitvoering.
Een IPG-strip is een dunne, meestal 3 tot 5 mm brede polyacrylamide-gelstrip die op een plastic drager (mylar) is aangebracht, met een lengte variërend van 7 tot 24 cm. Tijdens de fabricage worden zeven immobiline-monomeren met verschillende pKa-waarden (2 zure en 5 basische) in een gecontroleerde ratio aan het acrylamidemengsel toegevoegd. Bij de polymerisatie worden de immobilinegroepen covalent in het polymeernetwerk vastgelegd en zo ontstaat een pH-gradient die niet meer kan wegdrijven. Na polymerisatie wordt de strip gedroogd zodat deze langdurig bij +4 °C bewaard kan worden.
De keuze van de pH-range is bepalend voor de resolutie:
Voor een verkennende 2D-PAGE-analyse wordt vrijwel altijd begonnen met een pH 3–10 NL-strip om een globaal spotpatroon te verkrijgen. Op basis daarvan wordt gekozen of een tweede analyse op een smallere zoom-strip nodig is. Voor biofarmaceutische charge variant-analyse van monoklonale antilichamen (die vrijwel altijd een pI tussen 6 en 9 hebben) wordt standaard een pH 6–10 of pH 7–10 zoom-strip gebruikt.
Carrier ampholieten zijn synthetische mengsels van honderden kleine amfotere moleculen met verschillende pI-waarden, verkocht onder handelsnamen zoals Ampholine, Pharmalyte, Servalyte en Biolyte. In oplossing en onder een elektrisch veld sorteren deze moleculen zichzelf van laag pI aan de anode naar hoog pI aan de kathode en bouwen zo zelf een pH-gradient op — vandaar de naam "carrier". Voor de opkomst van IPG waren carrier ampholieten de enige praktische manier om een pH-gradient te maken.
De belangrijkste nadelen van carrier-ampholieten waren de cathodic drift (de gradient dreef langzaam weg richting de kathode omdat de basische ampholieten mobiel bleven), lage reproduceerbaarheid tussen partijen en een beperkte belasting met eiwitmonster. IPG-strips hebben deze problemen opgelost. Tegenwoordig worden carrier ampholieten alleen nog toegevoegd aan het rehydratatiemedium van IPG-strips (0,5 tot 2 %) om de geleidbaarheid te verbeteren en de opneming van hoog-abundante eiwitten te bevorderen. In de capillaire IEF (CIEF) worden nog wel primair carrier ampholieten gebruikt, omdat een IPG-vulling in een capillair praktisch niet uitvoerbaar is.
Een goede scheiding staat of valt met een correcte monstervoorbereiding. Het monster moet ontzout en volledig gedenatureerd worden, en mag zo min mogelijk geleidende ionen bevatten die het elektrische veld verstoren. De standaard lysebuffer voor IEF bevat 7 mol/L ureum, 2 mol/L thio-ureum, 2–4 % CHAPS (een zwitterionisch detergent), 20–50 mmol/L DTT als reductor en 0,5–2 % carrier ampholieten in het beoogde pH-bereik. SDS mag nadrukkelijk niet in de IEF-lysebuffer aanwezig zijn: het is anionisch en zou alle eiwitten netto negatief laden, waardoor focusing onmogelijk wordt. Voor membraaneiwitten worden vaak sterkere detergenten of chaotropen toegevoegd (ASB-14, sulfobetaine 3-10).
Voor plasma- of serummonsters wordt vaak eerst een immunodepletiestap uitgevoerd om albumine en IgG te verwijderen, aangezien deze twee eiwitten samen 70 % van het totaaleiwit vertegenwoordigen en anders het spotpatroon domineren. Zouten die in het monster zijn achtergebleven kunnen worden verwijderd via TCA/aceton-precipitatie, dialyse of kleinvolume ontzoutingskolommen; een restzoutconcentratie van meer dan 40 mmol/L veroorzaakt slechte focusing.
Er zijn twee gangbare methoden om eiwit op de IPG-strip te brengen:
De totale focusering wordt uitgedrukt in volt-uren (Vh), het product van spanning en tijd. Een typisch programma voor een 18 cm strip pH 3–10 kent drie of vier fases:
Voor pH 3–10 op een 18 cm strip is 60 000 Vh doorgaans voldoende; voor smalle zoom-strips (bijvoorbeeld pH 4–5) is 100 000 Vh of meer nodig omdat de effectieve migratieafstand groter is voor dezelfde pI-resolutie. De temperatuur wordt bij voorkeur op 20 °C geregeld met een Peltier-blok in de IEF-cel; hogere temperaturen versnellen focusering, maar bevorderen ook carbamylatie van lysine-residuen door de aanwezigheid van ureum (carbamylatie verandert het pI en verstoort het spotpatroon).
Voor IEF is een gespecialiseerde IEF-cel nodig omdat het proces bij zeer hoge spanning (tot 10 000 V) en lage stroom (typisch enkele mA per strip) plaatsvindt. Een gewone horizontale of verticale gelelektroforese-tank levert die spanning niet. Bovendien moet de strip actief gekoeld worden om lokale opwarming te voorkomen die de gradient zou verstoren. Moderne IEF-cellen combineren een geïntegreerde voeding, Peltier-koeling en een programmeerbaar spanningsverloop in één compact apparaat.
Na IEF alleen (dus 1D-IEF, zonder tweede dimensie) worden de eiwitten in de strip zichtbaar gemaakt met een kleuring. Voor zichtbaarheid moet de gel eerst worden gefixeerd (10 % TCA of 20 % ethanol / 10 % azijnzuur) om diffusie van gefocusseerde banden tijdens de kleurstap te voorkomen. Vervolgens gelden dezelfde kleuringen als bij Coomassie- en zilverkleuring van eiwitgels: colloïdaal Coomassie (detectielimiet 10–50 ng per band), zilverkleuring (0,1–1 ng, MS-compatibele variant zonder glutaaraldehyde) of fluorescente kleurstoffen als SYPRO Ruby.
Voor het aantonen van specifieke eiwitten volgt na IEF vaak een western blot-transfer naar een membraan met daarop een immunodetectie — een uitstekende manier om ladingvarianten van één specifiek eiwit zichtbaar te maken, bijvoorbeeld gefosforyleerde versus niet-gefosforyleerde vormen van een enzym. Voor pI-bepaling wordt de gel op een gecalibreerde pH-schaal geïnterpreteerd door mee te lopen met een pI-marker-mix (commercieel verkrijgbaar, met eiwitten van bekende pI over het gehele bereik).
De klassieke toepassing: IEF scheidt eiwitten in de eerste dimensie op pI, waarna de strip wordt geëquilibreerd met SDS en op een tweede-dimensiegel voor SDS-PAGE wordt gelegd. Het resultaat is een tweedimensionaal patroon waarin duizenden eiwitten gelijktijdig zijn opgelost. Zie voor de complete workflow het artikel proteomics en 2D-PAGE.
Bij de productie van monoklonale antilichamen (mAbs) ontstaan onvermijdelijk ladingvarianten door post-translationele modificaties: deamidering van asparagine of glutamine verlaagt het pI met circa 0,05–0,1 eenheid per plaats, C-terminale lysine-klivage verlaagt de nettolading, N-terminale pyroglutamaat-vorming verhoogt de nettolading, en glycatie of sialylering van glycanen kunnen het pI eveneens beïnvloeden. Voor kwaliteitscontrole in de biofarma wordt vrijwel altijd imaged capillary IEF (icIEF) gebruikt: een geautomatiseerd systeem dat het complete pI-profiel in 15–30 minuten registreert door de capillaire kolom optisch te scannen. De vereiste analyse wordt door regelgevende instanties zoals de EMA en FDA gezien als een standaard-batchreleasetest voor mAb-productie.
IEF is decennialang de gouden standaard geweest voor de screening op hemoglobine-varianten (HbS bij sikkelcelziekte, HbC, HbE, HbD) omdat de pI-verschillen tussen deze varianten net groot genoeg zijn (0,05–0,15 pH-eenheid) om via IEF te scheiden. Cellulose-acetaat- en agarose-IEF worden nog steeds in veel klinisch-chemische laboratoria toegepast, hoewel kation-uitwisselings-HPLC en massaspectrometrie tegenwoordig veel klinische IEF-toepassingen vervangen.
Enzymen kunnen in verschillende iso-enzym-vormen bestaan, die dezelfde katalytische reactie uitvoeren maar afwijken in aminozuursamenstelling — en dus in pI. Klassieke voorbeelden zijn lactaatdehydrogenase (LDH, vijf iso-enzymen met weefselspecifieke expressie), creatinekinase en alkalische fosfatase. IEF gevolgd door een activiteitskleuring (waarbij de enzymen op de gel hun eigen substraat omzetten en zo zichtbaar worden) geeft een direct visueel patroon van het iso-enzym-profiel. In de forensische biologie wordt IEF nog gebruikt voor esterase-D-typering.
Bij denaturerende IEF — verreweg de meest gebruikte vorm — wordt de rehydratatiebuffer sterk chaotroop (7 mol/L ureum + 2 mol/L thio-ureum + detergent) waardoor het eiwit volledig ontvouwt. Alle eiwitten scheiden dan op hun theoretische pI, ongeacht hun natieve conformatie of eventuele complexvorming. Bij native IEF wordt geen ureum of detergent gebruikt en blijft de eiwitconformatie intact. Dit maakt het mogelijk om native massaspectrometrie-achtige informatie te combineren met pI-scheiding: eiwit-eiwit-complexen blijven zichtbaar en behouden hun activiteit. Native IEF is technisch lastiger — geen ureum betekent minder oplosbaarheid en meer risico op neerslag bij het pI — maar essentieel voor iso-enzymkleuringen en voor conformatie-gevoelige toepassingen.
Bij capillaire iso-elektrische focusing wordt het scheidingsmedium naar een dunne kwartscapillair verplaatst (typisch 50–100 µm binnendiameter, 30–50 cm lang). Het capillair wordt gevuld met een mengsel van monster, carrier ampholieten en methylcellulose (om elektro-osmose te dempen). Aan de anodezijde wordt een verdunde fosforzuuroplossing aangebracht, aan de kathodezijde verdunde natriumhydroxide. Onder een aangelegd veld (typisch 500–800 V/cm) ontstaat in enkele minuten een pH-gradient waarin de eiwitten focusseren.
De detectie kan op twee manieren gebeuren:
Zie voor de bredere context van capillaire scheidingstechnieken het artikel capillaire elektroforese.
Voor preparatieve toepassingen — waarbij het doel is om een specifieke eiwitfractie in werkbare hoeveelheden af te scheiden — is gelmatrix ongeschikt: eiwitten moeten na scheiding intact uit de gel worden geëlueerd, wat inefficiënt is. Bij free-flow IEF stroomt het monster continu door een dunne, rechthoekige kamer waarin loodrecht op de stroomrichting een pH-gradient en een elektrisch veld staan. Eiwitten worden zijdelings afgebogen naar hun pI en verlaten de kamer via afzonderlijke fractie-uitgangen. FF-IEF verwerkt tot honderden milligrammen eiwit per uur en wordt onder meer ingezet in de eerste zuiveringsstap van complexe eiwitmengsels, voor het isoleren van organellen (mitochondriën, endosomen) op basis van hun oppervlakte-lading, en voor de fractionering van peptide-mixen vóór LC-MS-analyse in shotgun-proteomics.
Horizontal streaking wijst op onvolledige focusering: eiwitten hebben hun pI niet bereikt en liggen uitgesmeerd langs de gradient. Meest voorkomende oorzaken zijn te lage volt-uren, te hoge zoutconcentratie in het monster (verhoogt de stroom, verlaagt het effectieve voltage), of te veel eiwitmonster (overload verhindert scherpe banden). Oplossing: verhoog de focustijd, ontzout het monster met TCA-precipitatie of ontzoutingskolom, of verlaag de monsterbelasting.
Verticale streaking na 2D-PAGE ontstaat wanneer eiwitten in de IPG-strip zijn geaggregeerd of neergeslagen bij hun pI. Oplossing: verhoog de chaotroop-concentratie (thio-ureum toevoegen), verbeter de reductie (verse DTT of TCEP), of gebruik een sterker detergent (ASB-14 voor membraaneiwitten). Ook een grondiger equilibratiestap tussen IEF en SDS-PAGE helpt.
Zoals eerder besproken is cathodic drift bij moderne IPG-strips vrijwel verdwenen. Blijft het optreden — bijvoorbeeld bij een oude of onjuist bewaarde stripbatch — dan is vervanging de eerste actie. Gaps ("holes" in de banden) wijzen op lokale oververhitting; controleer of de Peltier-koeling correct werkt en of de strip goed contact maakt met het koelblok.
SDS is een sterk anionisch detergent dat zich in een vaste verhouding aan de eiwitketen bindt en zo alle eiwitten netto negatief laadt. Onder een elektrisch veld migreert een SDS-gecoat eiwit steeds richting de anode en bereikt nooit een netto lading van nul — er is dus geen pI om naar te focusseren. Om deze reden mag SDS niet in het IEF-monster of de rehydratatiebuffer aanwezig zijn. Wél mag na IEF de strip met SDS worden geëquilibreerd voor de tweede dimensie in 2D-PAGE: dan is de eerste-dimensiescheiding al voltooid.
Voor de preparatieve tegenhanger — waarbij eiwit op basis van lading in werkbare hoeveelheden wordt afgescheiden — is ionenwisselchromatografie vaak de logische keuze. IEF blijft de superieure analytische techniek voor pI-bepaling en voor het aantonen van kleine ladingsverschillen.
pKa is de dissociatieconstante van één specifieke ioniseerbare groep — bijvoorbeeld de carboxylgroep van een aminozuur of de imidazoolgroep van histidine. Het pI is een eigenschap van het hele molecuul: de pH waarbij de netto lading van alle groepen samen precies nul is. Voor een molecuul met slechts één zure en één basische groep is het pI het rekenkundig gemiddelde van beide pKa's; voor eiwitten met tientallen ioniseerbare groepen wordt het pI numeriek berekend of experimenteel bepaald via IEF. Zie ook het artikel over pH-meting en potentiometrische titratie voor de achtergrond van pKa-bepaling.
Bij pH-waarden verschillend van het pI dragen eiwitmoleculen een netto lading — allemaal positief of allemaal negatief — waardoor ze elkaar elektrostatisch afstoten en in oplossing blijven. Op het pI valt die afstoting weg omdat de netto lading nul is, en dominant worden de aantrekkende krachten (Van der Waals, hydrofobe interactie). Het gevolg is dat de eiwitten aggregeren en neerslaan. Deze eigenschap wordt in de iso-elektrische precipitatie praktisch benut voor eiwitzuivering — voor bijvoorbeeld caseïne uit melk (pI ≈ 4,6) door de melk tot pH 4,6 aan te zuren. Het is óók de oorzaak van "band-precipitation" bij IEF wanneer de eiwitconcentratie te hoog is voor de gebruikte pH-range.
Enkele referentiewaarden: humaan serumalbumine 4,7; ovalbumine 4,6; caseïne (α-s1) 4,4; hemoglobine A 6,9; myoglobine 7,0; ribonuclease A 9,6; lysozyme 11,4; cytochroom c 10,0; trypsine 10,5; chymotrypsinogeen 9,5. Deze waarden zijn experimentele isoelektrische punten uit gepubliceerde tabellen; berekende waarden kunnen 0,3 tot 1,0 eenheid afwijken door de eerder besproken structurele effecten.
Met een pH 3–10 brede strip en co-migratie van pI-markers is een pI met een onzekerheid van ±0,1 pH-eenheid haalbaar. Op een pH 4–7 smalle strip verbetert dit tot ±0,05, en op een zoom-strip (pH 4,5–5,5) tot ±0,01. icIEF met scanning-detectie bereikt onder optimale omstandigheden een reproduceerbaarheid van 0,02–0,05 pH-eenheid. Het is essentieel om binnen dezelfde run met interne pI-markers te lopen; kalibratie op externe strips is te onbetrouwbaar.
Ja, mits ze amfoteer zijn en genoeg ioniseerbare groepen bezitten. Peptiden vanaf circa 10 aminozuren scheiden goed op IEF; voor kortere peptiden en losse aminozuren wordt vaker HPLC of capillaire zone-elektroforese gebruikt omdat de resolutie op IEF-gel dan onvoldoende is voor het kleine formaat. Voor zeer basische eiwitten en peptiden (pI > 10) is speciale zorg nodig omdat de standaard-IPG-gradient tot pH 10 loopt; voor deze eiwitten worden aangepaste strips met een basisch bereik of speciale cup-loading-technieken gebruikt.
Ja, en dit is in de praktijk de belangrijkste vervolgstap. Na IEF (of 2D-PAGE) worden individuele spots uit de gel gesneden, in-gel verteerd met trypsine en de peptiden geëxtraheerd voor MALDI-TOF- of LC-MS-analyse. Voor charge variant analysis van mAbs wordt icIEF ook direct online gekoppeld aan een massaspectrometer (icIEF-MS), zodat het pI én de intacte massa van elke ladingvariant in één run worden bepaald. Voor peptide-pre-fractionering vóór shotgun-proteomics is offline free-flow IEF een gangbare route.
Ja. Elke fosfaatgroep die aan een serine, threonine of tyrosine wordt gekoppeld voegt bij fysiologische pH twee negatieve ladingen toe, wat het pI met ongeveer 0,2–0,5 pH-eenheid verlaagt (afhankelijk van het aantal fosforylaties en de omringende residuen). Op een 2D-gel is een fosforyleringstrap daarom vaak zichtbaar als een horizontale reeks spots met identieke molecuulmassa maar verschuivende pI — een klassiek herkenningspatroon voor multi-site fosforylering. Deze ladingtrap is ook waarneembaar met icIEF en wordt gebruikt in de kwaliteitscontrole van fosfo-eiwitten in bijvoorbeeld kinaseassays.
Chromatofocussering combineert het pI-principe met chromatografie: een monster wordt op een zwakke ionenwisselaarkolom gebracht en met een pH-gradient gedelueerd. Eiwitten verlaten de kolom in volgorde van hun pI. Het is preparatief (milligram tot gram schaal) en levert een fractie in oplossing in plaats van in een gel. Chromatofocussering geeft doorgaans een lagere pI-resolutie dan IEF (ΔpI ≈ 0,05), maar heeft als voordeel dat het native eiwit in werkbare hoeveelheid wordt afgescheiden zonder gelbewerking. Voor de bredere context zie het artikel over ionenwisselchromatografie.
Voor gerelateerde scheidingstechnieken en achtergrondbegrippen zie proteomics en 2D-PAGE, SDS-PAGE en het Laemmli-systeem, gelelektroforese, capillaire elektroforese, ionenwisselchromatografie, eiwitzuivering, eiwitkwantificering met Bradford, BCA en A280, Coomassie- en zilverkleuring van eiwitgels, western blot, pH-meting en potentiometrische titratie, iso-elektrische precipitatie, affiniteitschromatografie, circulair dichroïsme, DSC voor biomoleculen en massaspectrometrie.
Voor IEF- en 2D-PAGE-toepassingen levert Labvakhandel biotechnologie- en moleculair-biologische apparatuur, membraanfilters voor monstervoorbereiding, precisiepipetten voor het aanbrengen van kleine monstervolumes en pH-indicatoren en pH-buffers voor controle van uw rehydratatie- en focuseringsbuffers. Neem contact op voor advies over de juiste verbruiksmaterialen voor uw specifieke IEF- of 2D-PAGE-workflow.
Disclaimer: De informatie in dit artikel is bedoeld als algemene technische toelichting. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl aanvaardt geen aansprakelijkheid voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische, klinische of industriële situaties. Raadpleeg voor uw eigen toepassing altijd de geldende normen, vakliteratuur en de documentatie van fabrikant en apparatuur.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
