Southern blot en Northern blot zijn twee klassieke hybridisatietechnieken uit de moleculaire biologie waarmee specifieke DNA- of RNA-sequenties worden opgespoord in een complex mengsel. Beide technieken combineren scheiding van nucleïnezuren op grootte via gelelektroforese met overdracht naar een membraan en detectie via een complementaire, gelabelde probe. Het werkingsprincipe is in essentie identiek; het onderscheid zit uitsluitend in het doelmolecuul: Southern blot detecteert DNA, Northern blot detecteert RNA. Samen met de Western blot — die eiwitten detecteert — vormen zij de drie klassieke blot-technieken, vernoemd naar de windstreken als geografisch woordspel op de naam van de uitvinder van de eerste methode, Edwin Southern.
De Southern blot werd in 1975 beschreven door de Britse moleculair bioloog Edwin Southern als methode om specifieke DNA-fragmenten te detecteren na restrictie-digest en gelelektroforese. De methode was een doorbraak omdat zij voor het eerst toeliet om één specifieke sequentie te lokaliseren in een complex mengsel van miljoenen DNA-fragmenten. Twee jaar later, in 1977, beschreven Alwine, Kemp en Stark een analoge techniek voor RNA, die zij Northern blot noemden als bewust woordspel op de geografische naam van Southern. De naam “blot” zelf verwijst naar het overbrengen — het blotten — van moleculen van een gel naar een membraan of filter, vergelijkbaar met het “deppen” van vloeistof.
In de jaren daarna volgden de Western blot (eiwitten, Towbin e.a. 1979), de Eastern blot (lipiden en post-translationele modificaties) en de Southwestern blot (DNA-bindende eiwitten), maar deze laatste twee zijn aanzienlijk minder gangbaar. Het geografische naamschema is uitgegroeid tot een vaste benaming in de moleculaire biologie.
Ondanks hun verschillen in doelmolecuul verlopen beide blot-technieken volgens hetzelfde zevenstappenprincipe. Een goed begrip van dit gedeelde principe maakt het eenvoudig om de technieken naast elkaar te plaatsen en te begrijpen waar de protocollen van elkaar afwijken.
Bij Southern blot wordt genomisch DNA geïsoleerd (zie DNA-isolatie) en vervolgens geknipt in fragmenten met behulp van restrictie-endonucleasen. Dit zijn enzymen die dubbelstrengs DNA op specifieke, doorgaans palindromische, vier- tot achtbasenparen-sequenties knippen. De keuze van het restrictie-enzym bepaalt welke fragmenten ontstaan en daarmee hoe het bandpatroon eruit ziet. Voor het detecteren van een gen of locus wordt een enzym gekozen dat het doelgebied flankeert maar er niet doorheen snijdt.
Bij Northern blot wordt RNA geïsoleerd, typisch als totaal-RNA of na verrijking voor mRNA via poly-A-selectie. RNA-isolatie vereist een RNase-vrije omgeving: RNasen zijn alom aanwezig en uiterst stabiel. DEPC-water (diethylpyrocarbonaat-behandeld), RNase-vrije buizen en handschoenen zijn standaard. Een restrictie-digest is bij Northern blot niet nodig: RNA-moleculen zijn al enkelvoudig van nature en worden niet verder gefragmenteerd voor de run. Voor een uitgebreide beschrijving van isolatiemethoden, RIN-beoordeling en kwaliteitscontrole, zie het artikel over RNA-isolatie en RNA-analyse.
De nucleïnezuren worden gescheiden op grootte via agarosegel-elektroforese. Bij Southern blot wordt een standaard agarosegel (0,8–1,5% afhankelijk van de verwachte fragmentgrootte) gebruikt in TAE- of TBE-buffer. Grote fragmenten (groter dan 10 kilobasenparen) worden soms voorafgaand aan de elektroforese met beperkte zuurhydrolyse (depurinatie, zie stap 3) verkleind voor betere overdracht.
Bij Northern blot wordt een denaturerend formaldehyde-agarosegel gebruikt. RNA is van nature enkelvoudig en vormt secundaire structuren (haarlussen) die de migratie op de gel beïnvloeden. Formaldehyde in gel en laadbuffer denatureert het RNA volledig, zodat migratie uitsluitend op grootte berust. Dit is cruciaal voor het correct interpreteren van de RNA-grootte op het bandpatroon.
Bij Southern blot ondergaat de gel na elektroforese een drietrapsbehandeling: (1) depurinatie met verdund zoutzuur (0,25 M HCl, 10–15 minuten) om purinebasen gedeeltelijk af te splitsen en zo DNA-fragmenten groter dan 10 kb te knippen in kleinere stukken voor efficiëntere transfer, (2) denaturatie met natriumhydroxide/natriumchloride om de dubbelstreng te openen tot enkelvoudig DNA dat kan hybridiseren met de probe, en (3) neutralisatie met Tris-HCl/NaCl-buffer om de pH te herstellen voor optimale hybridisatie.
Bij Northern blot is de denaturatie al geborgd door het formaldehydegel. Na de elektroforese wordt de gel gespoeld en direct voorbereid voor transfer. Een extra denaturatiestap is niet nodig omdat RNA enkelvoudig is en al volledig gedenatureerd is door het formaldehyde.
De nucleïnezuren worden overgebracht van de gel naar een membraan. De klassieke methode is capillaire blotting (de oorspronkelijke methode van Edwin Southern): de gel wordt op een zoutoplossing-gedrenkt filtreerpapier gelegd, het membraan erop, dan een stapel droog filtreerpapier en papieren handdoeken. De capillaire kracht van de droge papieren zuigt de buffer op en trekt daarmee de nucleïnezuren mee vanuit de gel naar het membraan. Overdracht duurt 4–16 uur bij kamertemperatuur.
Snellere alternatieven zijn vacuümblotting (30–60 minuten via aangelegde onderdruk) en elektroforetische transfer via natte of semi-droge methoden — analoog aan de transfermethoden bij Western blot, maar dan voor nucleïnezuren. De membraankeuze is nylon (positief geladen nylon voor betere binding van negatief geladen nucleïnezuren) of nitrocellulose. Nylon is robuuster en kan vaker worden gehybridiseerd; nitrocellulose geeft een lagere achtergrond bij sommige detectiesystemen.
Na transfer worden de nucleïnezuren gefixeerd op het membraan via UV-crosslinking (bij nylon) of bakken bij 80°C in vacuüm (bij nitrocellulose). Dit vormt covalente bindingen tussen het nucleïnezuur en het membraan en voorkomt uitwassen tijdens de hybridisatiestappen.
Daarna volgt prehybridisatie: het membraan wordt geïncubeerd in een oplossing met geblokkeerde eiwitten (BSA, heparine, gedenatureerd zalm-sperma-DNA) om aspecifieke bindingsplaatsen te bezetten en de achtergrondafkleuring te minimaliseren. Vervolgens wordt de gelabelde probe toegevoegd. De probe is een enkelvoudig nucleïnezuur met een sequentie complementair aan het doelgebied; zij hybrideert selectief met de doelsequentie op het membraan. Hybridisatie vindt plaats bij een temperatuur en zoutconcentratie afgestemd op de stringentie: hoge stringentie (hoge temperatuur, lage zoutconcentratie) laat alleen perfect complementaire hybridisatie toe; lage stringentie staat ook minder perfecte matches toe. Na hybridisatie worden niet-gebonden probe-moleculen verwijderd door wasstrappen van toenemende stringentie.
De probe wordt gedetecteerd via de label waarmee hij is voorzien. Drie hoofdklassen:
Radioactieve detectie met ³²P-gelabeld fosfaat was de oorspronkelijke methode en is nog steeds de gevoeligste. Hybridisatie wordt zichtbaar gemaakt via autoradiografie op röntgenfilm of een phosphorimager. De techniek vereist een radioactief laboratorium, specifieke afvalverwerking en heeft een korte houdbaarheidsdatum van de probe (halveringstijd ³²P: 14,3 dagen).
Niet-radioactieve detectie heeft radioactiviteit grotendeels vervangen in moderne protocollen. DIG (digoxigenine)-gelabelde probes worden gedetecteerd met een anti-DIG-antilichaam gekoppeld aan alkalische fosfatase of HRP, gevolgd door chemiluminescentie. Biotine-gelabelde probes worden gedetecteerd via streptavidine-HRP met vergelijkbare chemiluminescentie-detectie. Gevoeligheid is vergelijkbaar met radioactieve detectie en de houdbaarheid van de probe is maanden tot jaren.
Fluorescente probes worden ingezet in specifieke toepassingen waarbij directe beeldvorming zonder enzymreactie gewenst is.
Het eindresultaat is een bandpatroon op film of in een digitaal beeld. Elke band representeert een fragment van een bepaalde grootte (uitgedrukt in kilobasenparen, kb) dat de doelsequentie bevat. De grootte wordt bepaald door vergelijking met een DNA-ladder of RNA-groottemarker die in een naastgelegen lane is meegelopen. De intensiteit van de band geeft een semi-kwantitatieve indruk van de hoeveelheid doelsequentie: een intensere band wijst op meer kopieën of hogere expressie.
Southern blot is de referentiemethode voor het detecteren van specifieke DNA-sequenties in een genomisch DNA-preparaat op basis van grootte en aanwezigheid. De techniek geeft antwoord op vragen als: is een bepaald gen aanwezig in het genoom? Op welk fragment zit het? Hoeveel kopieën zijn er? Is een transposon of transgeen op de verwachte locatie geïntegreerd?
Een essentieel concept is RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism): variaties in de DNA-sequentie tussen individuen of allelen leiden tot andere knippatronen door restrictie-enzymen, en dus tot banden van andere grootte op de Southern blot. RFLP-analyse via Southern blot was de eerste brede moleculaire genotyperingstechniek, lang vóór de komst van PCR-gebaseerde methoden.
Waarom treedt depurinatie op bij de Southern blot? Bij grote DNA-fragmenten — groter dan 10 kilobasenparen — is de overdracht van het gel naar het membraan via capillaire blotting inefficiënt: grote moleculen bewegen langzaam door de gelmatrix. Depurinatie met HCl verbreekt de glycosidische binding tussen de purinebasen (adenine, guanine) en de suiker-fosfaat-ruggengraat. Daardoor ontstaan alkali-labiele sites die bij de volgende denaturatiestap (NaOH) de ruggengraat breken en het DNA fragmenteren in kleinere stukken. Deze kleinere fragmenten transfereren sneller en volledig, zodat grote loci voldoende worden overgebracht. De depurinatiestap wordt bewust kort gehouden — te lang depurineren fragmenteert het DNA te sterk en geeft diffuse banden.
De vroege forensische DNA-profilering — de zogenoemde DNA-vingerafdruk — maakte gebruik van Southern blot gecombineerd met RFLP-analyse. Genomisch DNA werd met restrictie-enzymen geknipt, gesepareerd via gelelektroforese, overgebracht naar een membraan en gehybridiseerd met probes gericht op VNTR-loci (variable number of tandem repeats). Het resulterende patroon van banden was per individu uniek. Tegenwoordig is Southern blot-gebaseerde forensische profilering grotendeels vervangen door PCR-gebaseerde STR-analyse via capillaire elektroforese, die minder uitgangsmateriaal vereist en sneller is.
Een specifieke toepassing waar Southern blot nog steeds een rol speelt is de bevestiging van transgeenintegratie en kopietalbepaling in transgene dieren of planten. Door het genomische DNA te knippen met enzymen die de vector wel maar het transgeen niet snijden, en vervolgens te hybridiseren met een probe gericht op het transgeen, kan het aantal integratie-events en het integratiepatroon worden bepaald. PCR kan aanwezigheid bevestigen maar kan kopieaantal minder betrouwbaar aantonen.
Northern blot is de directe methode om de grootte en de expressie van een RNA-transcript te bepalen in een biologisch monster. De techniek geeft antwoord op: wordt dit gen tot expressie gebracht in dit weefsel of onder deze conditie? Wat is de grootte van het transcript? Zijn er alternatieve spleisvormen zichtbaar? Neemt expressie toe of af onder een bepaalde behandeling?
Een Northern blot levert daarmee informatie die complementair is aan PCR-gebaseerde technieken: RT-qPCR is gevoeliger en kwantitatiever, maar geeft geen informatie over de grootte van het transcript of de aanwezigheid van alternatieve spleisvormen. Northern blot is trager en minder gevoelig maar geeft een direct “visueel bewijs” van het transcript en zijn grootte dat bij publicaties als overtuigende verificatie gold.
Northern blot is semi-kwantitatief. De intensiteit van de band correleert met de hoeveelheid RNA in het monster, maar de techniek is niet volledig lineair en niet zo nauwkeurig als RT-qPCR of RNA-sequencing. Om expressieniveaus te vergelijken tussen monsters wordt een referentietranscript — een housekeeping-gen zoals GAPDH of 18S-rRNA — tegelijkertijd gedetecteerd als ladingscontrole. Normalisatie op het referentietranscript verwijdert variatie door ongelijke RNA-belading.
Voor Northern blot wordt bij voorkeur positief geladen nylonmembraan gebruikt. De negatieve lading van RNA bindt sterker aan positief geladen nylon dan aan nitrocellulose of niet-geladen nylon. Positief geladen nylon geeft hogere bindingscapaciteit, hogere gevoeligheid en kan worden gestript en opnieuw gehybridiseerd. Filtreerpapier in de capillaire blotstapel heeft uitsluitend een mechanische functie — het geleiden van de bufferflow — en is geen kritisch materiaal voor de uitkomst.
Northern blot is in de meerderheid van toepassingen vervangen door gevoeliger en snellere methoden. RT-qPCR is de standaard voor expressieanalyse in het hedendaagse laboratorium; RNA-sequencing biedt een transcriptoom-breed beeld zonder voorkennis van de doelsequentie. Northern blot heeft specifieke niches behouden waar de combinatie van groottebepaling en expressieanalyse in één experiment gewenst is, en bij validatie van nieuwe transcripten of spleisvormen die niet in referentiedatabases staan. Ook in de klinische virologie wordt Northern blot occasioneel ingezet voor directe detectie van virale RNA-genomen van bekende grootte.
De probe is het molecuul dat de specificiteit van de detectie bepaalt. Een probe is een enkelvoudig nucleïnezuur met een sequentie complementair aan het doelgebied. Hybridisatie berust op Watson-Crick-basenparing: A-T en G-C bij DNA, A-U bij RNA. De probe brengt het detectie-label mee naar de locatie van de doelsequentie.
PCR en Southern blot zijn complementair: PCR amplificeert een specifieke sequentie met hoge gevoeligheid maar vereist voorkennis van de flankeringssequentie en kan de grootte van het totale fragment niet bepalen zonder agarosegel. Southern blot vereist geen primers en kan elke sequentie detecteren waarvoor een probe beschikbaar is; de techniek levert tevens directe informatie over de fragmentgrootte en het kopieaantal via restrictiepatronen. SNP-arrays en genotypering hebben RFLP-Southern blot vervangen voor grootschalige genotypering; voor kleinschalige bevestiging van specifieke loci of integratiebepaling blijft Southern blot relevant.
RT-qPCR is sneller, gevoeliger en kwantitatiever dan Northern blot, maar geeft geen informatie over de grootte van het transcript. RNA-seq biedt een volledig transcriptoom-breed beeld inclusief alternatieve spleisvormen en nieuw beschreven transcripten, maar vereist meer bioinformatica-expertise en is kostbaarder per sample bij kleine series. Northern blot heeft als unieke voordeel dat de grootte van een transcript direct zichtbaar is en dat alternatieve spleisvormen als afzonderlijke banden zichtbaar worden — informatie die in RT-qPCR verloren gaat als er niet specifiek op alternatieve spleisvormen wordt ontworpen.
Southern blot werd en wordt ingezet voor de diagnose van erfelijke aandoeningen waarbij klassieke PCR-gebaseerde methoden onvoldoende zijn. Een voorbeeld is de detectie van trinucleotide-herhalingsuitbreidingen bij Fragile X-syndroom en Huntington: de herhalingslengtes overstijgen de betrouwbare amplificatiegrens van PCR, waarna Southern blot de enige methode is die de volledige uitbreidingslengte betrouwbaar weergeeft. Ook grote deleties, inversies en complexe rearrangementen in het genoom worden via Southern blot bevestigd wanneer array-CGH of NGS geen eenduidig beeld geven.
Northern blot wordt ingezet in moleculair biologisch onderzoek waarbij de expressie van een specifiek gen onder verschillende condities of in verschillende weefsels wordt vergeleken. Voorbeelden zijn: het aantonen van stressrespons-genen, het meten van inductie door hormonen of cytokinen, het vergelijken van expressie in normaal versus tumorweefsel, en het documenteren van alternatieve spleisvormen. In de publicatieliteratuur geldt een Northern blot nog steeds als direct bewijs van transcriptexpressie.
De DNA-vingerafdruk op basis van RFLP-Southern blot, geïntroduceerd door Alec Jeffreys in 1984, was de grondslag voor DNA-profilering in forensisch onderzoek en vaderschapstests. Elke persoon heeft een uniek RFLP-patroon; vergelijking van patronen van verdachte en spoormateriaal gaf de rechter moleculair bewijs. Tegenwoordig is dit vervangen door STR-PCR-capillaire elektroforese, die minder materiaal vereist en sneller is, maar het historische belang van Southern blot voor forensische en juridische toepassingen is aanzienlijk.
In de productie van transgene organismen — muizen, ratten, planten, cellijnen — is Southern blot de klassieke methode voor bevestiging dat het transgeen is geïntegreerd in het genoom (en niet als extrachromosomaal element aanwezig is) en voor het bepalen van het kopieaantal. Na de opkomst van CRISPR-Cas9-genoombewerking wordt Southern blot ingezet als aanvullende verificatiemethode naast sequencing voor het bevestigen van correcte integratie.
Southern blot is gebruikt voor de bevestiging van HPV-integratie in het menselijke genoom bij cervixcarcinoom-onderzoek, voor de detectie van retrovirale integratie-events, en voor de karakterisering van virale genomen. Northern blot is ingezet voor directe detectie van RNA-virussen met een bekend transcriptprofiel, zoals HIV en hepatitis C. In moderne diagnostische laboratoria zijn specifieke PCR-assays sneller en gevoeliger, maar blot-technieken bieden soms een aanvullende dimensie.
Het grootste risico bij Northern blot is RNA-degradatie door RNasen. RNasen zijn buitengewoon stabiel, zijn actief zonder cofactoren en worden niet geïnactiveerd door autoclaveren. Maatregelen: gebruik DEPC-behandeld water voor alle oplossingen, werk met RNase-vrije buizen en tips, draag handschoenen doorlopend, behandel werkoppervlakken met RNase-vrije decontaminatieoplossing (RNaseZap of vergelijkbaar), en bewaar RNA bij −80°C in aliquots.
Te lage stringentie (te hoge zoutconcentratie of te lage temperatuur) geeft aspecifieke banden door hybridisatie van de probe met niet-perfect-complementaire sequenties. Te hoge stringentie wast ook de specifieke hybride weg, wat resulteert in zwakke of afwezige banden. De optimale stringentie hangt af van de GC-inhoud en de lengte van de probe en wordt empirisch bepaald.
Als praktisch startpunt wordt de smelttemperatuur (Tm) van het probe-doelduplex berekend. Voor langere probes (groter dan 50 nt) geldt de vuistregel Tm = 81,5 + 16,6 × log[Na⁺] + 0,41 × %GC − 500/n, waarbij n de probelengte in nucleotiden is en [Na⁺] de natriumconcentratie in mol/liter. De wastemperatuur wordt ingesteld op 5–10°C onder de berekende Tm; de zoutconcentratie in de wasbuffer (typisch 0,1×SSC tot 2×SSC) stuurt de stringentie verder bij. Voor korte oligonucleotide-probes (17–25 nt) is de vereenvoudigde formule Tm = 2 × (A+T) + 4 × (G+C) voldoende nauwkeurig als startpunt.
Onvolledige overdracht van nucleïnezuren van gel naar membraan is een veelvoorkomende oorzaak van zwakke of afwezige signalen. Controle is mogelijk door de gel na transfer te kleuren met ethidiumbromide of SYBR Safe: een gel waaruit alle nucleïnezuren zijn overgebracht, geeft geen banden meer. Bij grote DNA-fragmenten (groter dan 10 kb) is de depurinatiestap cruciaal voor volledige overdracht.
Hoge achtergrond bij detectie wordt veroorzaakt door onvoldoende prehybridisatieblokkering of te korte wasstrappen. Voeg meer geblokkeerd-zalm-sperma-DNA toe aan de hybridisatiebuffer of verleng de wasstrappen. Bij chemiluminescentie-detectie is te lange blootstellingstijd van de film ook een oorzaak van hoge achtergrond.
Northern blot staat in de literatuur ook bekend als RNA blot of RNA transfer hybridisatie. De term “Northern blotting” is de meest gebruikte aanduiding en is universeel herkenbaar. In sommige oudere publicaties wordt de techniek aangeduid als “Northern transfer” of “Northern hybridisatie.”
Southern en Northern blot zijn onderdeel van een bredere methodologische familie in de moleculaire biologie. Voor de eiwitvariant zie Western blot. De scheiding van nucleïnezuren als eerste stap wordt uitgebreid beschreven in het artikel over gelelektroforese. DNA-isolatie als uitgangsmateriaal voor Southern blot wordt behandeld in DNA-isolatie. Hybridisatie met gelabelde probes is ook het detectieprincipe achter SNP-genotypering via microarrays — zie SNP-genotypering en PCR-technieken. Voor kwantificering van mRNA-expressie zonder groottebepaling is RT-qPCR / real-time PCR sneller en gevoeliger. Een transcriptoom-breed alternatief voor Northern blot is next-generation sequencing (RNA-seq). Capillaire scheiding van DNA-fragmenten als basis voor moderne forensische profilering staat beschreven bij capillaire elektroforese. Fragmentatie van DNA voor blot en NGS-toepassingen via sonicatie. Voor genoombewerking waarbij Southern blot als verificatiemethode dient: CRISPR-Cas9. Detectie van eiwitten die door Northern blot-gemeten transcripten worden gecodeerd gaat via Western blot, ELISA of immunohistochemie (IHC). Voor fluorescentie-gebaseerde detectiesystemen bij blot-toepassingen zie fluorescentie-spectroscopie. Voor chromosomale lokalisatie van DNA-sequenties in intacte cellen is FISH (fluorescentie-in-situ-hybridisatie) de aanvullende in-situ-methode.
Voor verbruiksartikelen bij blot-toepassingen — membranen, filtreerpapieren, hybridisatieovens, reagentia — kunt u het assortiment bekijken via biotechnologie & moleculaire biologie of contact opnemen voor advies.
DNA wordt geïsoleerd, geknipt met restrictie-endonucleasen, gescheiden op grootte via agarosegel-elektroforese, gedenatureerd en overgebracht naar een nylon- of nitrocellulosemembraan. Na fixatie hybrideert een gelabelde probe met de complementaire doelsequentie op het membraan. Na wasstrappen wordt de probe gedetecteerd via radioactiviteit of chemiluminescentie, wat een bandpatroon geeft waaruit de grootte en aanwezigheid van de doelsequentie wordt afgelezen.
Southern blot detecteert specifieke DNA-sequenties via hybridisatie met een nucleïnezuur-probe; scheiding op grootte gaat via agarosegel-elektroforese. Western blot detecteert specifieke eiwitten via binding met een antilichaam; scheiding op grootte gaat via SDS-PAGE. Het werkingsprincipe — scheiding, transfer, blokkering, specifieke detectie — is analoog, maar de doelmoleculen, reagentia en detectiechemie zijn fundamenteel verschillend.
DNA-vingerafdrukken (forensische DNA-profilering) is een toepassing van Southern blot. In de klassieke methode van Jeffreys (1984) werd genomisch DNA via RFLP-Southern blot geanalyseerd: het restrictie-digest-patroon was per individu uniek en kon dienen als identificatieprofiel. Tegenwoordig is de term DNA-vingerafdruk losser geworden en omvat ook PCR-gebaseerde STR-profilering. Southern blot is de techniek; DNA-vingerafdrukken is een toepassing ervan.
In de hybridisatiestap van een forensische RFLP-Southern blot hybrideert een probe gericht op VNTR-loci (variable number of tandem repeats) met de gefixeerde DNA-fragmenten op het membraan. De VNTR-loci zijn bij ieder individu anders in lengte en geven daardoor een uniek bandpatroon. Vergelijking van het bandpatroon van het spoormateriaal met dat van een verdachte of referentiemonster maakt identificatie of uitsluiting mogelijk.
Een Southern blot-resultaat is een autoradiogram of chemiluminescentiefilm met één of meer banden. De positie van de band ten opzichte van de meegelopen DNA-ladder geeft de fragmentgrootte in kilobasenparen. De aanwezigheid van een band bevestigt dat het doelgen of de doelsequentie aanwezig is in het monster; afwezigheid van een band kan wijzen op deletie of verlies van het doelgebied. Meerdere banden kunnen wijzen op meerdere kopieën, meerdere allelen of een keuze van restrictie-enzym dat het doelgebied snijdt. De intensiteit van de band geeft een indicatie van het kopieaantal.
Beide zijn hybridisatietechnieken waarbij nucleïnezuren worden gescheiden op grootte, overgebracht naar een membraan en gedetecteerd met een gelabelde probe. Southern blotting detecteert DNA-sequenties na restrictie-digest; Northern blotting detecteert RNA-transcripten en geeft informatie over expressieniveau en transcriptgrootte. Het onderscheid zit in het doelmolecuul en de gel- en monstervoorbereiding; het fundamentele principe is identiek.
Ja, Southern blot is specifiek ontworpen voor de detectie van DNA-sequenties. De techniek detecteert genomisch DNA na fragmentatie met restrictie-enzymen. Bij een correct uitgevoerde Southern blot met een probe van voldoende specificiteit kan één kopie van een doelsequentie in het menselijke genoom worden aangetoond, mits voldoende uitgangsmateriaal wordt gebruikt (typisch 5–10 μg genomisch DNA per lane).
Isoleer RNA in RNase-vrije omstandigheden, bepaal de concentratie en integriteit via spectrofotometrie en agarosegel-elektroforese, laad gelijke hoeveelheden RNA op een denaturerend formaldehydegel, voer elektroforese uit, blot capillair naar een positief geladen nylonmembraan, fixeer via UV-crosslinking, blokkeer met prehybridisatiebuffer, hybridiseer met gelabelde probe (radioactief of DIG/biotin), was de niet-gebonden probe weg in wascondities van toenemende stringentie, en detecteer via autoradiografie of chemiluminescentie.
Northern blot is primair kwalitatief (aanwezig/afwezig) en semi-kwantitatief. De bandintensiteit correleert met de hoeveelheid RNA maar de relatie is niet volledig lineair. Voor nauwkeurige kwantificering van expressieniveaus is RT-qPCR de aangewezen methode. Northern blot biedt wel unieke kwalitatieve informatie over transcriptgrootte en alternatieve spleisvormen die RT-qPCR niet geeft.
De voornaamste nadelen zijn: de noodzaak van grote hoeveelheden uitgangs-RNA (microgrambereik), de kwetsbaarheid van RNA voor RNase-degradatie, de tijdsduur van het volledige protocol (doorgaans twee tot drie dagen inclusief hybridisatie), de lagere gevoeligheid vergeleken met RT-qPCR, en bij gebruik van radioactieve probes de bijbehorende strikte regelgeving. Deze nadelen verklaren waarom Northern blot in de dagelijkse laboratoriumroutine grotendeels is vervangen door moleculaire alternatieven.
Voor een Southern blot is per lane doorgaans 5–10 μg genomisch DNA nodig om één kopie van een doelsequentie in het menselijke genoom betrouwbaar te detecteren met radioactieve of chemiluminescentie-detectie. Voor niet-repetitieve sequenties met lage kopieaantallen wordt soms tot 20 μg gebruikt. Voor een Northern blot wordt per lane gewoonlijk 5–30 μg totaal-RNA of 1–5 μg poly-A-geselecteerd mRNA geladen, afhankelijk van het expressieniveau van het doeltranscript. Laagabundante transcripten vereisen meer uitgangsmateriaal; hoogexpressieve genen kunnen al zichtbaar zijn bij 1 μg totaal-RNA. Dit hoge RNA-verbruik is een van de redenen dat Northern blot voor kleine biopsiemonsters moeilijk uitvoerbaar is.
Formaldehyde dient als denaturerend middel in de agarosegel en laadbuffer van een Northern blot. RNA is van nature enkelvoudig maar vormt uitgebreide secundaire structuren — haarlussen, stamlusstructuren en pseudoknopen — die zijn migratiesnelheid in de gel beïnvloeden en daarmee de bepaling van de werkelijke molecuulgrootte verstoren. Formaldehyde reageert reversibel met de aminogroepen van de nucleobasen en verhindert zo hervorming van secundaire structuren tijdens de elektroforese. Het resultaat is dat RNA-moleculen volledig uitgestrekt migreren en dat de bandpositie op de gel uitsluitend door de molecuullengte in nucleotiden wordt bepaald. Zonder formaldehyde-denaturatie zouden RNA-banden op afwijkende posities terechtkomen en zou de transcriptgrootte incorrect worden afgelezen.
Beide technieken detecteren specifieke nucleïnezuur-sequenties met behulp van een complementaire, gelabelde probe, maar zij verschillen fundamenteel in context en informatietype. Southern blot werkt met geëxtraheerd, gefragmenteerd DNA dat buiten de cel op een membraan wordt geanalyseerd; de uitkomst is een bandpatroon waaruit fragmentgrootte en aanwezigheid van de doelsequentie worden afgelezen. FISH (fluorescentie-in-situ-hybridisatie) wordt uitgevoerd op intacte cellen of chromosoompreparaten; de probe hybrideert direct in de cel of op het chromosoom, zodat de chromosomale locatie van de doelsequentie zichtbaar wordt onder de microscoop. Southern blot geeft informatie over fragmentgrootte en kopieaantal op moleculaire schaal; FISH geeft informatie over de chromosomale positie en het aantal kopieën per cel in ruimtelijke context. In de diagnostiek worden beide methoden soms gecombineerd: Southern blot voor kwantificering van uitbreidingslengtes, FISH voor chromosomale lokalisatie.
Een volledige Southern blot-procedure neemt doorgaans twee tot vier dagen in beslag. Dag één omvat de restrictie-digest van het genomische DNA (2–4 uur), gelelektroforese (4–16 uur bij lage spanning) en de gelbehandelingsstappen (depurinatie, denaturatie, neutralisatie; samen 1–2 uur). De capillaire transfer duurt 4–16 uur en verloopt vaak 's nachts. Dag twee omvat fixatie, prehybridisatie (1–2 uur) en hybridisatie met de probe (4–16 uur bij 65°C). Op dag drie of vier volgen wasstrappen (1–2 uur) en detectie via autoradiografie of chemiluminescentie (blootstellingstijd afhankelijk van signaalsterkte: uren tot 24 uur). Door het gebruik van vacuümblotting (30–60 minuten transfer) en chemiluminescentie-detectie kan de totale doorlooptijd worden verkort tot circa twee dagen, maar de procedure is altijd meerdaags en daarmee aanzienlijk tijdsintensiever dan PCR-gebaseerde alternatieven.
Northern blot kan worden uitgevoerd op RNA afkomstig uit uiteenlopende biologische bronnen, mits het RNA van voldoende kwaliteit en hoeveelheid is. De meest gebruikte monsterbronnen zijn vers of diepgevroren weefsel (lever, hersenen, spier, tumorweefsel), gekweekte cellen die direct in lysisbuffer worden geoogst, en perifeer bloed of geïsoleerde PBMC’s. Vers materiaal heeft sterk de voorkeur: RNA-degradatie begint onmiddellijk na afname doordat RNasen vrijkomen bij cellyse. Diepgevroren materiaal (bewaard bij −80°C, bij voorkeur in RNAlater of vergelijkbaar medium) is geschikt mits de vriesopslag direct na afname heeft plaatsgevonden. Formaline-gefixeerde, paraffineingebedde (FFPE) weefsels zijn in principe bruikbaar maar leveren sterk gedegradeerd RNA dat Northern blot doorgaans onmogelijk maakt; voor FFPE-materiaal is RT-qPCR de aangewezen methode. Plantaardig materiaal, gistculturen en bacteriëel totaal-RNA worden eveneens gebruikt in onderzoekscontexten, waarbij de isolatieprocedure wordt aangepast aan de celwandsamenstelling van het uitgangsmateriaal.
Gelelektroforese en Southern blotting worden in combinatie ingezet voor elke toepassing waarbij de identiteit, grootte of kopieaantal van een specifieke DNA-sequentie in een complex genomisch mengsel moet worden vastgesteld. De elektroforese scheidt de DNA-fragmenten op grootte en maakt het bandpatroon zichtbaar; Southern blotting maakt vervolgens detectie van één specifieke sequentie in dat patroon mogelijk via hybridisatie. Praktische toepassingen zijn: diagnose van erfelijke aandoeningen met trinucleotide-herhalingsuitbreidingen (Fragile X, Huntington), bevestiging van transgeenintegratie en kopietalbepaling in transgene organismen, forensische DNA-profilering op basis van RFLP-analyse, detectie van virale integratie-events (HPV, retrovirussen), en verificatie van genoomedits bij CRISPR-Cas9-experimenten. In al deze gevallen biedt de combinatie van elektroforetische groottescheiding met Southern blot-hybridisatie informatie die met PCR alleen — zonder kennis van de precieze flankeringssequentie of fragmentgrootte — niet of minder betrouwbaar te verkrijgen is.
Bij Labvakhandel vindt u elektroforesesystemen, pipetten en membraanfilters voor blottingprocedures.
Disclaimer: De informatie in dit artikel is bedoeld als algemene technische toelichting. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl aanvaardt geen aansprakelijkheid voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische, klinische of industriële situaties. Raadpleeg voor uw eigen toepassing altijd de geldende normen, vakliteratuur en de documentatie van fabrikant en apparatuur.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
