Het supernatant is de vloeistof die boven een bezinksel staat nadat de vaste deeltjes uit een mengsel naar de bodem zijn gezakt, meestal door centrifugeren. Het is een van de meest gebruikte woorden in laboratoriumprotocollen en tegelijk een stap waar veel mis kan gaan: wie het supernatant slordig afneemt, verliest product of neemt ongewild deeltjes mee. Dit artikel legt uit wat een supernatant is, hoe het ontstaat, wat erin zit, hoe u het afneemt zonder de pellet te verstoren, wanneer u het bewaart en wanneer u het weggooit, en welke rol het speelt in celkweek, eiwitonderzoek, DNA-isolatie, bloedonderzoek en de analytische chemie. De werking van de centrifuge zelf staat in het artikel over laboratoriumcentrifuges; de chemie van het neerslaan in precipitatie als scheidingstechniek.
Een supernatant is de vloeistoflaag die boven een sediment, neerslag of pellet blijft staan nadat vaste deeltjes van een vloeistof zijn gescheiden door centrifugeren, bezinken of neerslaan. De vloeistof is doorgaans helder en bevat alles wat opgelost is gebleven of te klein en te licht was om mee te bezinken. In het Nederlands wordt ook de term bovenstaande vloeistof gebruikt.
Supernatant betekent letterlijk bovenop drijvend. Het woord komt van het Latijnse supernatare, samengesteld uit super (boven) en natare (zwemmen, drijven). In het laboratorium duidt het de vloeistof aan die boven het bezonken materiaal staat. Het Engels gebruikt hetzelfde woord, supernatant, en daarnaast de kortere vorm supernate.
Beide komen voor. In Nederlandstalige protocollen en studieboeken is het supernatant het gebruikelijkst; de supernatant wordt daarnaast ook gebruikt. Het meervoud is supernatanten. Wie een neutrale Nederlandse term zoekt, schrijft de bovenstaande vloeistof of kortweg het bovenstaande.
Het supernatant is de vloeistof bovenin de buis, de pellet is het samengepakte vaste materiaal op de bodem of tegen de wand. Samen vormen zij de twee fracties van één scheiding. Welke van de twee u nodig hebt, hangt af van het doel: bij het oogsten van cellen is de pellet het product en het supernatant afval, bij het klaren van een cellysaat is het precies andersom. De pellet wordt ook sediment, bezinksel of, na een neerslagreactie, precipitaat genoemd.
Beide zijn de vloeistof die na een scheiding van vast en vloeibaar overblijft; het verschil zit in de methode. Het supernatant ontstaat doordat deeltjes onder invloed van zwaartekracht of centrifugaalkracht bezinken en de vloeistof erboven blijft staan. Het filtraat ontstaat doordat de vloeistof door een filter loopt en de deeltjes op het filter achterblijven. Een filtraat is vrij van alle deeltjes die groter zijn dan de poriën van het filter; een supernatant kan nog zeer fijne of lichte deeltjes bevatten. De technieken worden vaak gecombineerd: eerst centrifugeren, daarna het supernatant filtreren. De filtratiemethoden staan in filtratie in het laboratorium.
Een supernatant ontstaat wanneer deeltjes met een hogere dichtheid dan de vloeistof naar de bodem bewegen en de vloeistof erboven achterblijft. Dat gebeurt op drie manieren: door centrifugeren, door bezinken onder zwaartekracht en na een neerslagreactie of kristallisatie. Een overzicht van deze en andere scheidingsmethoden staat in scheidingstechnieken.
In een centrifuge draait de buis met hoge snelheid rond. De centrifugaalkracht, vele malen groter dan de zwaartekracht, drijft deeltjes die zwaarder zijn dan de vloeistof naar buiten, dat wil zeggen naar de bodem of de buitenwand van de buis. Daar pakken zij samen tot een pellet. De vloeistof die overblijft, is het supernatant. Hoe groter en zwaarder het deeltje, hoe lager de kracht en hoe korter de tijd die nodig is. Cellen bezinken al bij enkele honderden malen de zwaartekracht, celresten bij ruim tienduizend maal, en de kleinste celonderdelen pas in een ultracentrifuge. De keuze van toerental, rotor en looptijd wordt behandeld in de centrifuge-keuzewijzer.
Ja. Wanneer een suspensie stilstaat, zakken de deeltjes onder invloed van de zwaartekracht vanzelf naar de bodem. Dit heet sedimentatie of bezinken. Het duurt langer dan centrifugeren, van minuten voor zand en grove kristallen tot uren of dagen voor fijn slib, en het bezinksel is losser. De heldere vloeistof erboven is ook dan het supernatant. De methode wordt gebruikt bij grove neerslagen, bij bodem- en slibmonsters en in de waterzuivering, waar het bovenstaande water na bezinking wordt afgelaten. Zeer fijne deeltjes en colloïden bezinken niet vanzelf; daarvoor is een centrifuge of een vlokmiddel nodig.
Bij een neerslagreactie vormt zich in een oplossing een onoplosbare vaste stof, het precipitaat. Voegt u bijvoorbeeld een oplossing van zilvernitraat toe aan een oplossing van natriumchloride, dan ontstaat wit zilverchloride dat naar de bodem zakt. De vloeistof erboven bevat de ionen die in oplossing zijn gebleven en is het supernatant. In de klassieke analyse wordt de volledigheid van een neerslag gecontroleerd door aan het heldere supernatant een extra druppel reagens toe te voegen: blijft de vloeistof helder, dan is de neerslag volledig. Bij kristallisatie heet het supernatant de moederloog; de werkwijze staat in kristallisatie als zuiveringstechniek.
Een supernatant bevat het oplosmiddel, alle opgeloste stoffen en de deeltjes die bij de gebruikte kracht en tijd niet zijn bezonken. Wat dat precies is, hangt af van het uitgangsmateriaal en van de centrifugeercondities. Een supernatant is dus geen vaste stof of standaardoplossing, maar een fractie waarvan de samenstelling door de scheiding wordt bepaald.
Nee. Een supernatant is helder wanneer alle deeltjes die licht verstrooien zijn bezonken. Het blijft troebel wanneer de centrifugaalkracht of de looptijd te laag was, wanneer de pellet bij het uitnemen is opgewerveld, wanneer er vetdeeltjes in zweven of wanneer het materiaal zeer fijne deeltjes bevat. Een gekleurd supernatant is niet hetzelfde als een troebel supernatant: kleur wijst op opgeloste stoffen, troebeling op zwevende deeltjes. De troebeling zelf is te meten; de methode staat in turbidimetrie en nefelometrie.
Niet zonder meer. Bevat een monster vet, dan vormt dat na centrifugeren een drijvende laag bovenop de vloeistof. Het waterige deel daaronder is dan de fractie die u nodig hebt; het wordt infranatant genoemd, of in de praktijk gewoon het supernatant onder de vetlaag. U neemt het af door met de pipetpunt door de vetlaag heen te steken of door de vetlaag eerst te verwijderen. Bij een tweefasensysteem van water en een organisch oplosmiddel spreekt men niet van supernatant maar van de bovenste en de onderste fase; dat is het terrein van vloeistof-vloeistofextractie.
U neemt het supernatant af door het af te schenken, af te pipetteren of af te zuigen, zonder de pellet te raken of op te wervelen. Welke methode past, hangt af van de stevigheid van de pellet, het volume en de vraag welke fractie u nodig hebt. Haal de buizen direct na het stilvallen van de rotor uit de centrifuge en werk vlot: een pellet die lang in de vloeistof staat, wordt losser en kan gedeeltelijk weer in suspensie gaan.
De techniek van het opzuigen zelf, met de juiste snelheid en hoek, staat in pipetteren; in de kennisbank vindt u daarnaast een SOP voor pipetteren.
Giet af wanneer de pellet stevig vastzit, het volume groot is en het supernatant niet verder wordt gebruikt, zoals bij het oogsten van bacteriën uit een kweek. Pipetteer wanneer de pellet los, klein of onzichtbaar is, wanneer het supernatant zelf het product is of wanneer het volume klein is. Bij een DNA- of RNA-pellet na alcoholprecipitatie is pipetteren de veilige keuze: de pellet is vaak nauwelijks te zien en glijdt bij afgieten gemakkelijk mee.
Dat hangt af van de fractie die u nodig hebt. Is het supernatant het product, laat dan liever een ruime rest staan dan dat u pelletmateriaal meeneemt; in een microbuisje is dat ongeveer 10 tot 50 microliter. Is de pellet het product, dan wilt u juist zo weinig mogelijk supernatant achterlaten, omdat het restje de volgende stap verontreinigt. In dat geval wast u de pellet: resuspenderen in schone buffer, opnieuw centrifugeren en het wassupernatant afnemen. Blijft er 50 microliter achter en wast u met 1 milliliter, dan wordt het restant per wasstap ongeveer twintigmaal verdund, na twee wasstappen ongeveer vierhonderdmaal.
Meng de buis opnieuw en centrifugeer nogmaals, zo nodig langer of met een hogere kracht. Probeer een opgewervelde pellet niet te ontwijken met de pipet; de deeltjes zitten dan al in de vloeistof. Losse pellets komen vooral voor bij lage krachten, bij plantaardig en vetrijk materiaal en bij buizen die na het centrifugeren te lang hebben gestaan. Het helpt om de rem van de centrifuge uit te schakelen of zachter te zetten, zodat de vloeistof bij het afremmen niet gaat kolken.
Dat bepaalt het protocol, en het wisselt soms binnen één protocol van stap tot stap. Gooi daarom nooit een fractie weg voordat u zeker weet dat de gewenste stof in de andere fractie zit. De tabel geeft voor veelvoorkomende toepassingen aan welke fractie het product is.
Er zijn drie mogelijkheden. Is het supernatant het product, dan brengt u het over naar een schone, gelabelde buis en werkt u ermee verder of bewaart u het gekoeld. Is het een tussenproduct, dan volgt vaak een tweede centrifugatiestap bij hogere kracht of een filtratie. Is het afval, dan voert u het af volgens de regels voor het betreffende materiaal: biologisch materiaal wordt geïnactiveerd, oplosmiddelen gaan in het daarvoor bestemde afvalvat. Bij twijfel bewaart u beide fracties tot het resultaat van de volgende stap bekend is.
Bij differentiële centrifugatie wordt het supernatant van elke stap opnieuw gecentrifugeerd bij een hogere kracht. Zo wordt een celhomogenaat stap voor stap in zijn onderdelen gesplitst: elke pellet bevat een zwaardere fractie, elk supernatant gaat door naar de volgende ronde. De tabel geeft de gangbare orde van grootte; de exacte waarden verschillen per celtype en protocol.
Een S9-fractie is het supernatant dat overblijft nadat een weefselhomogenaat, meestal van lever, bij 9.000 × g is gecentrifugeerd. De S staat voor supernatant, het getal voor de centrifugaalkracht in duizendtallen. De fractie bevat zowel de microsomen als het cytosol en daarmee het grootste deel van de enzymen die lichaamsvreemde stoffen omzetten. Zij wordt gebruikt in onderzoek naar de afbraak van geneesmiddelen en in mutageniteitstesten, om de omzetting van een stof in de lever na te bootsen. Op dezelfde manier is een S100-fractie het supernatant na 100.000 × g: het cytosol.
In celkweek en microbiologie is het supernatant het kweekmedium nadat de cellen eruit zijn verwijderd. Het bevat alles wat de cellen tijdens de groei hebben uitgescheiden en alles wat zij van het medium hebben overgelaten. Daarmee is het zowel een product als een bron van informatie over de toestand van de kweek.
Celkweeksupernatant is het medium waarin cellen hebben gegroeid, na verwijdering van de cellen door centrifugeren. Het wordt ook geconditioneerd medium genoemd. Het bevat de eiwitten die de cellen uitscheiden: antilichamen bij hybridoma- en productiecellijnen, cytokinen bij immuuncellen, groeifactoren, enzymen en bij geïnfecteerde kweken ook virusdeeltjes. Voor het afnemen worden zoogdiercellen gewoonlijk enkele minuten bij 200 tot 300 × g gecentrifugeerd, een kracht die de cellen laat bezinken zonder ze te beschadigen. De achtergrond van het kweken staat in celkweektechnieken.
Een celvrij supernatant is een supernatant waaruit alle cellen aantoonbaar zijn verwijderd, doorgaans door centrifugeren gevolgd door filtratie over een membraan van 0,22 of 0,45 micrometer. De term wordt vooral in de microbiologie gebruikt, bijvoorbeeld bij onderzoek naar stoffen die bacteriën uitscheiden, zoals enzymen, toxinen, signaalmoleculen en remmende stoffen. Door het supernatant celvrij te maken, weet u zeker dat een waargenomen effect door de uitgescheiden stoffen komt en niet door de cellen zelf. Bacteriën vragen een hogere kracht dan zoogdiercellen: enkele duizenden malen g gedurende tien minuten. Het volgen van de groei van zo'n kweek staat in celgroei meten met OD600.
Centrifugeer het kweekmedium om cellen en celresten te verwijderen, breng het supernatant over naar een schone buis zonder de pellet te raken en meet direct of vries het in porties in. Deeltjes in het monster verstoren de binding in de plaat en geven een verhoogde achtergrond. Verdun het supernatant zo nodig in de verdunningsbuffer van de test, zodat het signaal binnen het bereik van de kalibratielijn valt. Neem als blanco vers medium mee dat niet met cellen in contact is geweest, omdat serum in het medium zelf een signaal kan geven. Het principe van de test staat in ELISA.
Virusdeeltjes en extracellulaire blaasjes, zoals exosomen, zijn zo klein dat zij bij gewone centrifugatie in het supernatant blijven. Zij worden gewonnen in stappen: eerst worden cellen en celresten bij lage en middelhoge kracht verwijderd, daarna wordt het supernatant gefiltreerd en vervolgens geconcentreerd, door ultracentrifugatie of met membraantechnieken. Het concentreren van grote volumes wordt behandeld in tangential flow filtration.
In de biochemie en de moleculaire biologie is het afnemen van een supernatant een terugkerende handeling, maar de rol van de fractie verschilt per techniek. Bij eiwitwerk is het supernatant meestal het product, bij het neerslaan van DNA en RNA juist het afval, en bij bloed is het de fractie waarop de meeste bepalingen worden gedaan.
Een geklaard lysaat is het supernatant dat overblijft nadat opengebroken cellen zijn gecentrifugeerd, gewoonlijk tien tot vijftien minuten bij 12.000 tot 16.000 × g en 4 °C. De pellet bevat celresten, membranen en onoplosbare eiwitten; het supernatant bevat de oplosbare eiwitten. Het is het uitgangspunt voor de eiwitbepaling, voor gelelektroforese en voor chromatografische zuivering. Een eiwit dat in de pellet terechtkomt in plaats van in het supernatant, is onoplosbaar tot expressie gekomen of geaggregeerd. De methoden om cellen open te breken staan in celontsluiting, de vervolgstappen in eiwitzuivering en de concentratiebepaling in eiwitkwantificering.
Dat verschilt per stap. Na het lyseren en neerslaan van eiwitten en celresten zit het DNA in het supernatant, dat u bewaart. Na toevoeging van ethanol of isopropanol slaat het DNA neer; na centrifugeren zit het in de pellet en is het supernatant afval. Bij de wasstap met 70 procent ethanol wordt het supernatant opnieuw weggenomen. Juist in dit protocol gaat het vaak mis doordat de verkeerde fractie wordt weggegooid of doordat de vrijwel onzichtbare pellet met het supernatant wordt meegezogen. De volledige werkwijze staat in DNA-isolatie.
Ja. Wanneer een bloedbuis wordt gecentrifugeerd, zakken de bloedcellen naar de bodem en blijft de vloeibare fractie bovenin staan. Is het bloed eerst gestold, dan is die fractie serum; is de stolling met een antistollingsmiddel voorkomen, dan is het plasma. Tussen de rode bloedcellen en het plasma ligt een dunne lichte laag van witte bloedcellen en bloedplaatjes. In de klinische chemie spreekt men van serum en plasma en niet van supernatant, maar het principe is hetzelfde.
Eiwitten in plasma en serum vervuilen de kolom en verstoren de meting. Door een overmaat organisch oplosmiddel toe te voegen, gewoonlijk drie delen acetonitril of methanol op één deel monster, slaan de eiwitten neer. Na centrifugeren zit het neergeslagen eiwit in de pellet en de te meten stof in het supernatant, dat wordt geïnjecteerd of eerst wordt ingedampt. De methode is snel, maar verwijdert niet alle storende stoffen; wat achterblijft kan het signaal beïnvloeden, zoals wordt uitgelegd in matrixeffecten.
Een troebel supernatant maakt u helder door opnieuw te centrifugeren bij een hogere kracht of gedurende langere tijd, door het te filtreren of door beide te combineren. Ga eerst na waardoor de troebeling ontstaat; de tabel geeft de meest voorkomende oorzaken.
Dat is nodig wanneer het supernatant volledig deeltjesvrij moet zijn: vóór injectie in een HPLC-systeem, vóór een chromatografiekolom, voor steriel gebruik in celkweek en bij optische metingen. Een spuitfilter van 0,45 micrometer verwijdert fijne deeltjes, een filter van 0,22 micrometer houdt ook bacteriën tegen. Kies een membraan dat weinig eiwit bindt wanneer het supernatant eiwitten bevat die u wilt behouden, en houd rekening met het dode volume van het filter bij kleine monsters. De keuze van filtertype en poriegrootte staat in de filtratie-keuzewijzer.
Een supernatant bewaart u in een schone, afgesloten en gelabelde buis, gekoeld en zo kort mogelijk. Biologische supernatanten zijn beperkt houdbaar: enzymen breken eiwitten af en bacteriën kunnen in een voedingsrijk medium uitgroeien. Houd het monster daarom tijdens het werk op ijs.
Dat hangt af van wat erin zit. Als richtlijn geldt voor biologische supernatanten: enkele uren op ijs, één tot enkele dagen bij 2 tot 8 °C en maanden bij −20 of −80 °C. Verdeel het supernatant vóór het invriezen in porties voor eenmalig gebruik, want herhaald invriezen en ontdooien beschadigt eiwitten. Aan een lysaat worden remmers van eiwitafbrekende enzymen toegevoegd. Na het ontdooien kan een neerslag ontstaan; centrifugeer het monster dan kort en gebruik het heldere deel. De stabiliteit van een specifieke stof stelt u vast in uw eigen validatie. Het koud bewaren van monsters wordt behandeld in koelen en vriezen in het laboratorium.
Het supernatant heeft niet hetzelfde volume als het oorspronkelijke monster: de pellet neemt ruimte in en er blijft vloeistof achter. Voor een concentratiebepaling is dat geen bezwaar, omdat de concentratie van een opgeloste stof in het supernatant gelijk blijft. Voor een opbrengstberekening wel: noteer het volume dat u werkelijk hebt afgenomen. Is er bij de opwerking een reagens toegevoegd, bijvoorbeeld drie delen oplosmiddel op één deel monster, dan is het supernatant viermaal verdund en vermenigvuldigt u de gemeten concentratie met vier. Het rekenen met verdunningen staat in verdunningsreeksen bereiden.
Een supernatant is even gevaarlijk als het materiaal waaruit het is verkregen. Het supernatant van een geïnfecteerde kweek, van bloed of van een bacteriecultuur kan ziekteverwekkers bevatten, ook als het helder is. Bij het openen van buizen, afschenken en afzuigen ontstaan bovendien fijne druppeltjes die in de lucht blijven zweven.
De internationale uitgangspunten voor veilig werken met biologisch materiaal, waaronder het voorkomen van aerosolen bij centrifugeren, zijn beschreven in het Laboratory biosafety manual van de Wereldgezondheidsorganisatie.
De meeste fouten komen neer op het verliezen van de gewenste fractie of het meenemen van de ongewenste. De tabel geeft de fouten die in de praktijk het vaakst voorkomen.
De Nederlandse omschrijving is bovenstaande vloeistof. In de laboratoriumpraktijk wordt vrijwel altijd het woord supernatant zelf gebruikt, ook in Nederlandstalige protocollen.
De pellet: het vaste materiaal dat na centrifugeren onder in de buis ligt. Bij bezinken zonder centrifuge heet het sediment of bezinksel, na een neerslagreactie precipitaat. Bij een drijvende laag is de tegenhanger het infranatant, de vloeistof onder die laag.
Niet precies. Een oplossing is een homogeen mengsel van een oplosmiddel en opgeloste stoffen. Een supernatant is de vloeistof die na een scheiding boven het bezinksel staat; het is meestal een oplossing, maar kan ook nog zeer fijne zwevende deeltjes bevatten. Het woord supernatant zegt dus iets over de herkomst van de vloeistof, niet over de samenstelling.
Alleen als het protocol dat aangeeft. Bij het oogsten en wassen van cellen en bij het neerslaan van DNA is het supernatant afval. Bij het klaren van een lysaat, bij celkweek voor uitgescheiden eiwitten en bij bloed is het juist het product. Twijfelt u, bewaar dan beide fracties.
Ja, en dat is vaak nuttig. Een tweede centrifugatie bij hogere kracht verwijdert fijnere deeltjes die in de eerste ronde in oplossing zijn gebleven. Bij differentiële centrifugatie is dit zelfs het principe: elk supernatant gaat door naar een volgende, zwaardere stap.
Een buis met een conische bodem. De pellet verzamelt zich in de punt, waardoor het supernatant tot dicht bij de bodem kan worden afgenomen zonder de pellet te raken. Een buis met ronde bodem verdeelt de pellet over een groter oppervlak en is geschikter wanneer de pellet daarna weer moet worden opgelost. De verschillen staan in de centrifugebuis-keuzewijzer.
Een supernatant ontstaat door bezinken of centrifugeren. Een eluaat is de vloeistof die van een kolom of een vaste drager komt nadat de gebonden stof met een elutiebuffer is losgemaakt. Bij zuivering met magnetische bolletjes of harsdeeltjes komen beide woorden voor: de vloeistof die na binding wordt afgenomen, is het supernatant of de doorloop; de vloeistof die na elutie wordt afgenomen, is het eluaat.
Voor het scheiden van monsters en het afnemen van supernatant vindt u bij Labvakhandel laboratoriumcentrifuges, centrifugebuizen, pipetten en spuitfilters voor het nafiltreren. Neem contact op voor advies over de juiste combinatie van centrifuge, rotor en buizen voor uw toepassing.
Geschreven door Labvakhandel, specialist in laboratoriumbenodigdheden voor bedrijven en instellingen.
Disclaimer: De informatie in dit artikel is bedoeld als algemene technische toelichting. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl aanvaardt geen aansprakelijkheid voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische, klinische of industriële situaties. Raadpleeg voor uw eigen toepassing altijd de geldende normen, vakliteratuur en de documentatie van fabrikant en apparatuur.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
