Spectroscopie is het vakgebied dat onderzoekt hoe straling en materie op elkaar inwerken. Een stof kan licht absorberen, uitzenden, verstrooien of er op een andere manier op reageren, en hoe sterk dat gebeurt hangt af van de golflengte. Wordt die reactie uitgezet tegen de golflengte, dan ontstaat een spectrum: een patroon dat kenmerkend is voor de stof en dat daarom als een soort vingerafdruk dient. Daarmee beantwoordt spectroscopie vragen als: welke stof is dit, hoeveel zit er in het monster en hoe is het molecuul opgebouwd? Dit artikel geeft het overzicht. Het legt het principe uit, beschrijft het elektromagnetisch spectrum en de opbouw van een spectroscopisch instrument, vergelijkt de belangrijkste technieken en verwijst voor de details naar de artikelen over de afzonderlijke methoden.
Spectroscopie bestudeert de wisselwerking tussen elektromagnetische straling en materie als functie van de golflengte, de frequentie of de energie van die straling. Uit die wisselwerking volgt informatie over de samenstelling, de concentratie en de structuur van een stof. Spectroscopie is een overkoepelende term: absorptiespectroscopie, emissiespectroscopie, fluorescentiespectroscopie, infraroodspectroscopie en NMR zijn allemaal vormen ervan.
Het woord is opgebouwd uit spectrum (beeld, verschijning) en het Griekse skopein (kijken, waarnemen). Letterlijk is spectroscopie dus het bekijken van spectra. In het laboratorium betekent het het meten en interpreteren van spectra om stoffen te identificeren, te kwantificeren en hun structuur op te helderen.
Spectroscopie is geen apparaat maar een vakgebied en een verzameling meetmethoden. Wie naar “een spectroscopie” vraagt, bedoelt meestal een bepaalde techniek, zoals UV/Vis- of infraroodspectroscopie, of het instrument waarmee die wordt uitgevoerd. Dat instrument heet afhankelijk van het type een spectroscoop, spectrograaf, spectrometer of spectrofotometer; het verschil leest u verderop in dit artikel.
Een spectrum is de verdeling van straling of van een meetsignaal over een reeks golflengten, frequenties of energieën. Het bekendste voorbeeld is de kleurenband die ontstaat wanneer wit licht door een prisma wordt gesplitst. In de analytische praktijk is een spectrum een grafiek: op de horizontale as staat de golflengte, de frequentie of het golfgetal, op de verticale as de absorptie, de transmissie of de intensiteit van het uitgezonden licht. Pieken, banden en dalen in die grafiek horen bij specifieke eigenschappen van het monster.
Een eenduidig synoniem bestaat niet, omdat het woord in verschillende vakgebieden net iets anders betekent. In de natuurkunde en chemie komen spectrale verdeling, kleurenband (bij zichtbaar licht) en golflengtepatroon het dichtst in de buurt. In het gewone taalgebruik betekent spectrum ook een breed bereik of een reeks, zoals in “het hele spectrum aan toepassingen”.
Spectroscopisch betekent: betrekking hebbend op spectroscopie of op het meten van spectra, bijvoorbeeld in “spectroscopische gegevens” of “een spectroscopische bepaling”. Het woord spectraal wordt in dezelfde zin gebruikt, bijvoorbeeld bij “spectrale analyse” en “spectrale bandbreedte”.
Er is niet één vader. Isaac Newton legde in de zeventiende eeuw de basis door met een prisma te laten zien dat wit licht uit kleuren bestaat. In 1814 beschreef Joseph von Fraunhofer honderden donkere lijnen in het zonnespectrum. Gustav Kirchhoff en Robert Bunsen toonden rond 1860 aan dat elk element een eigen patroon van lijnen heeft, waarmee spectroscopie een analysemethode werd. Zij ontdekten met die methode ook de elementen cesium en rubidium. Veel bronnen noemen daarom Kirchhoff en Bunsen de grondleggers van de analytische spectroscopie.
Ja. Zichtbaar licht is een deel van het elektromagnetisch spectrum, de reeks van elektromagnetische golven die loopt van radiogolven tot gammastraling. Al die straling heeft dezelfde aard en verschilt alleen in golflengte, frequentie en energie. Straling gedraagt zich daarbij zowel als golf als als stroom van deeltjes, fotonen. De energie van een foton is omgekeerd evenredig met de golflengte: E = h · c / λ. Kortere golflengte betekent dus meer energie per foton. Dat bepaalt wat de straling met een molecuul kan doen en daarmee welke spectroscopische techniek bij welk gebied hoort.
Dit zijn drie manieren om dezelfde straling te beschrijven. De golflengte (λ) is de afstand tussen twee opeenvolgende golftoppen en wordt meestal in nanometer (nm) uitgedrukt; de frequentie (ν) is het aantal trillingen per seconde. Het golfgetal is het aantal golven per centimeter (cm−1) en is de gangbare eenheid in de infraroodspectroscopie. Een golfgetal is gelijk aan 1 gedeeld door de golflengte in centimeter. Hoe hoger het golfgetal, hoe korter de golflengte en hoe groter de energie.
De tabel laat zien welk effect straling in elk gebied op een molecuul of atoom heeft en welke technieken daarvan gebruikmaken. De grenzen zijn indicatief, want de gebieden gaan vloeiend in elkaar over.
Microgolven (1 mm tot 1 m) laten moleculen draaien en gammastraling raakt de atoomkern; beide komen in het gewone analytische laboratorium weinig voor en vallen buiten dit overzicht.
Het basisprincipe is bij alle technieken gelijk. Een bron levert straling, het monster wisselwerkt met die straling, en een detector meet wat er van over is of wat het monster uitzendt. Die meting wordt uitgezet tegen de golflengte, waarna het spectrum met referentiegegevens wordt vergeleken. Atomen en moleculen kunnen alleen bepaalde energiehoeveelheden opnemen, en dat zijn precies de energieën die bij hun eigen opbouw horen. Daardoor geeft elke stof een eigen patroon, en dat patroon maakt identificatie mogelijk. De mate van absorptie of emissie op een gekozen golflengte hangt bovendien samen met de concentratie, en daarmee is dezelfde meting ook kwantitatief bruikbaar.
Dit is de gangbare indeling naar het soort wisselwerking. Bij absorptiespectroscopie meet u hoeveel straling het monster opneemt, zoals bij UV/Vis, infrarood en atoomabsorptie. Bij emissiespectroscopie meet u het licht dat het monster zelf uitzendt nadat het is aangeslagen, bijvoorbeeld door een vlam, plasma of een belichting; fluorescentie en atomaire emissie vallen hieronder. Bij verstrooiingsspectroscopie meet u het licht dat het monster in andere richtingen verstrooit en dat daarbij van energie verandert, zoals bij Raman. NMR vormt een eigen groep, omdat daar de kernen in een magnetisch veld radiogolven opnemen. Een indeling in vier hoofdtypen, namelijk absorptie, emissie, verstrooiing en magnetische resonantie, is daarmee een praktische samenvatting.
Een absorptiespectrum toont bij welke golflengten het monster straling opneemt. Een emissiespectrum toont bij welke golflengten het monster straling uitzendt. Een continu spectrum bevat alle golflengten zonder onderbreking, zoals het licht van een gloeilamp. Een lijnenspectrum bestaat uit enkele scherpe lijnen en is typerend voor vrije atomen in gasvorm: elk element heeft zijn eigen lijnen. Moleculen en vloeistoffen geven in plaats daarvan brede banden.
Atoomspectroscopie meet vrije atomen in de gasfase, zoals in een vlam, een grafietoven of een plasma. U ziet scherpe lijnen en bepaalt welke elementen aanwezig zijn en in welke hoeveelheid; voorbeelden zijn atoomabsorptie, vlamfotometrie en ICP-OES. Molecuulspectroscopie meet hele moleculen, meestal in oplossing of als vaste stof. De spectra bestaan uit brede banden die iets zeggen over bindingen, functionele groepen en structuur. UV/Vis, infrarood, Raman en NMR horen daarbij.
In de praktijk worden de termen vaak door elkaar gebruikt en geven moderne instrumenten voor hetzelfde getal aan. Strikt genomen is absorptie het verlies aan lichtintensiteit door opname van fotonen, terwijl extinctie alle oorzaken van verzwakking omvat, dus ook verstrooiing aan deeltjes. Bij helder opgeloste monsters is het verschil verwaarloosbaar; bij troebele monsters of suspensies is de gemeten extinctie hoger dan de absorptie alleen. Meer daarover vindt u in het artikel over UV/Vis-spectrofotometrie.
UV/Vis meet de absorptie van ultraviolet en zichtbaar licht door een oplossing. Op basis van de wet van Lambert-Beer, A = ε · c · l, is die absorptie evenredig met de concentratie van de lichtabsorberende stof. Zo bepaalt u bijvoorbeeld de concentratie van eiwitten (absorptie bij 280 nm), van DNA en RNA (260 nm) en van kleurstoffen of kleurreacties in het zichtbare gebied. Met de Lambert-Beer-calculator rekent u absorptie en concentratie om.
Dat hangt van de techniek af. UV/Vis, infrarood, nabij-infrarood, Raman, NMR en XRF tasten het monster in de regel niet aan, zodat het na de meting kan worden hergebruikt. Bij atoomabsorptie en ICP wordt het monster juist verneveld en geatomiseerd in een vlam of plasma en gaat het verloren. Voor schaarse of kostbare monsters is dat een belangrijk criterium bij de keuze van de methode.
De namen van spectroscopische instrumenten worden in het dagelijks taalgebruik door elkaar gebruikt, maar ze verschillen in wat het instrument kan. De tabel geeft het onderscheid in oplopende volgorde van functionaliteit.
Een spectroscoop is een eenvoudig optisch instrument dat licht door een nauwe spleet laat vallen en met een prisma of tralie uiteenlegt in zijn kleuren. U kijkt direct naar het spectrum of fotografeert het. De spectroscoop laat zien welke golflengten aanwezig zijn, maar meet niet hoeveel licht er per golflengte is. Zodra een detector de intensiteit numeriek registreert, spreekt men van een spectrometer. Het verschil met de spectrometer is dus dat de spectroscoop alleen toont en de spectrometer meet.
Dat hangt af van de lichtbron. Een gloeilamp geeft een continu spectrum, een doorlopende kleurenband. Een TL-buis of spaarlamp laat een lijnenspectrum zien, met enkele heldere lijnen van kwik op een zwakkere achtergrond van licht van het fosforlaagje; fluorescentielicht is dus met een spectroscoop te onderzoeken. Daglicht laat een continu spectrum zien met daarin donkere lijnen, de Fraunhofer-lijnen. Die ontstaan doordat elementen in de koelere buitenlaag van de zon bepaalde golflengten absorberen. Een donkere lijn betekent dus dat op die golflengte licht is opgenomen door een stof tussen de bron en de waarnemer. Een heldere lijn duidt op een stof die dat licht zelf uitzendt.
Richt de spleet op de lichtbron die u wilt onderzoeken en kijk door het oculair, waarna u de spleet of de scherpstelling bijstelt tot de lijnen scherp zijn. Richt een spectroscoop nooit direct op de zon: gebruik daglicht van een bewolkte of lichte hemel of gereflecteerd licht. Voor lampen en vlammen houdt u de spleet vlak voor de bron.
Een spectrograaf splitst licht in zijn golflengten en legt het spectrum vast, vroeger op een fotografische plaat, nu op een camera of detector. De term wordt veel gebruikt in de sterrenkunde, waar een spectrograaf aan een telescoop wordt gekoppeld om de samenstelling van sterren en de snelheid van hemellichamen te bepalen. Ook in een Raman-opstelling voert een spectrograaf met detector de spectrale ontleding uit. In de praktijk lopen de termen spectrograaf en spectrometer door elkaar.
Een spectrometer is een instrument dat een spectrum meet: de intensiteit van straling als functie van de golflengte. Het is de overkoepelende term voor allerlei meetinstrumenten en omvat dus ook de spectrofotometer. Het woord wordt ook gebruikt voor instrumenten die geen licht maar ionen scheiden, zoals de massaspectrometer, die op een heel ander principe berust. Het onderliggende vakgebied heet spectrometrie: het kwantitatief meten van spectrale grootheden.
Een optische spectrometer bestaat uit een lichtbron, een manier om het licht te splitsen, een monsterruimte en een detector. De lichtbron zendt straling uit, het monster absorbeert, verstrooit of zendt licht uit, en een prisma of tralie ontleedt het licht in golflengten. De detector, zoals een diode-array of CCD, meet vervolgens de intensiteit per golflengte, en software zet dat om in een spectrum. Een FTIR-instrument werkt anders: dat gebruikt een interferometer in plaats van een prisma of tralie en rekent het signaal met een wiskundige transformatie om in een spectrum.
Een spectrometer wordt gebruikt om stoffen te identificeren, concentraties te bepalen en structuren op te helderen. Voorbeelden zijn de controle op metalen in water, de bepaling van vocht en eiwit in voedingsmiddelen, de identificatie van grondstoffen in een farmaceutisch laboratorium en de analyse van kleurstoffen. Buiten het laboratorium gebruikt de sterrenkunde spectrometers om de samenstelling van sterren te bepalen.
Een spectrofotometer is een spectrometer die de absorptie of transmissie van licht door een monster meet bij een instelbare golflengte. Dat maakt het instrument geschikt voor kwantitatieve analyse van oplossingen. Het is dus een subtype van de spectrometer. Een uitgebreide beschrijving van de opbouw, de instrumenttypen en het gebruik staat in het artikel over de spectrofotometer als apparaat; voor de keuze van een instrument is er de spectrofotometer-keuzewijzer.
Een UV/Vis-spectrofotometer meet absorptie in het ultraviolette en het zichtbare gebied. Daarvoor heeft hij doorgaans een deuteriumlamp voor het UV en een wolfraamlamp voor het zichtbare licht. Voor metingen onder ongeveer 320 nm zijn cuvetten van kwarts nodig, omdat glas en gewone kunststof daar licht absorberen. Een Vis-instrument werkt alleen in het zichtbare gebied en volstaat voor kleurreacties.
Een lichtbron zendt licht uit, een monochromator selecteert een smalle golflengte, en dat licht gaat door een cuvet met het monster. Een detector meet de intensiteit van het doorgelaten licht. De spectrofotometer vergelijkt die waarde met de meting van een blanco en berekent daaruit de absorptie. Via een ijklijn met oplossingen van bekende concentratie volgt de concentratie in het monster. Bij een enkelbundelinstrument worden blanco en monster na elkaar gemeten; bij een dubbelbundelinstrument gelijktijdig.
Spectrofotometrie is de meetmethode waarmee u uit de absorptie van licht de concentratie van een stof bepaalt. U maakt een reeks standaardoplossingen, meet de absorptie van elk bij dezelfde golflengte en zet die uit tegen de concentratie. Daarna meet u het monster en leest u de concentratie af. Een goede meting vraagt om een blanco, een absorptie in het lineaire bereik en een juiste ijklijn, zie kalibratielijn en lineariteit. Voor kleurreacties zijn ook de fotometrische en colorimetrische bepalingen van belang.
Spectroscopie is het brede vakgebied; spectrofotometrie is daarvan het deelgebied dat de absorptie of transmissie van licht meet, meestal in het UV/Vis-gebied. Alle spectrofotometrie is spectroscopie, maar niet alle spectroscopie is spectrofotometrie. FTIR en NMR zijn bijvoorbeeld spectroscopie, maar geen spectrofotometrie in de klassieke zin.
De tabel vergelijkt de belangrijkste technieken in het analytisch laboratorium. De technieken zijn gerangschikt naar de vraag die ze beantwoorden.
Massaspectrometrie staat in de tabel omdat het in de praktijk bij de spectrometrie wordt gerekend, maar het is strikt genomen geen spectroscopie: het meet ionen en geen interactie met straling.
De belangrijkste soorten spectroscopie zijn UV/Vis-spectroscopie voor concentraties, infraroodspectroscopie (FTIR en NIR) voor bindingen en identificatie, Raman-spectroscopie als aanvulling daarop, NMR voor de moleculaire structuur, fluorescentiespectroscopie voor zeer lage concentraties en atoomspectroscopie (AAS, ICP, vlamfotometrie) voor elementen. Welke daarvan u nodig heeft, hangt af van de vraag en van het monster.
Wilt u weten hoeveel van een gekleurde stof, een eiwit of DNA in een oplossing zit, dan is UV/Vis de eerste keuze. Wilt u een onbekend materiaal identificeren of weten welke functionele groepen het bevat, dan is FTIR geschikt, eventueel aangevuld met Raman. Gaat het om een zeer klein deeltje of een vezel, dan combineert microspectroscopie FTIR of Raman met een microscoop. Voor een snelle controle op vocht, vet of eiwit in een grondstof is NIR gangbaar. Metalen in water bepaalt u met AAS of ICP; de elementsamenstelling van een vast materiaal zonder oplossen met XRF. Wilt u weten in welke kristalvorm een stof voorkomt, dan is röntgendiffractie (XRD) geschikt. Voor de volledige opheldering van de structuur van een organisch molecuul is NMR de krachtigste techniek, vaak in combinatie met massaspectrometrie. Verandert de structuur van een eiwit, dan geeft circulair dichroïsme daarover informatie.
Voorbeelden zijn de bepaling van de eiwitconcentratie in een extract met UV/Vis, de controle op de identiteit van een farmaceutische grondstof met FTIR, de bepaling van zware metalen in drinkwater met AAS of ICP, de structuuropheldering van een nieuw gesynthetiseerde verbinding met NMR en de snelle vochtbepaling in graan met NIR. In de sterrenkunde wordt het spectrum van sterlicht gebruikt om de samenstelling, de temperatuur en de snelheid van sterren af te leiden.
Spectroscopie zit in veel instrumenten die u elders tegenkomt: een pulsoximeter gebruikt de absorptie van rood en infrarood licht, gasdetectoren meten gassen als koolstofdioxide via infraroodabsorptie, en in de voedingsindustrie bewaken NIR-meters de kwaliteit van grondstoffen. Ook de kleurmeting van verf en textiel berust op spectrale metingen. Deze voorbeelden laten zien dat dezelfde principes buiten het laboratorium worden toegepast.
Spectroscopie is snel, vaak niet-destructief en meestal met weinig monster uit te voeren. Daardoor is het de basis van veel routinemetingen in de wateranalyse, de voedingsmiddelenindustrie en de farmacie. Een belangrijk argument voor de brede toepassing is dat dezelfde meting zowel kwalitatief (welke stof) als kwantitatief (hoeveel) bruikbaar is.
De kwaliteit van een spectroscopische meting wordt bepaald door de voorbereiding. Meet altijd eerst een blanco met hetzelfde oplosmiddel of dezelfde matrix als het monster, zodat de absorptie van het oplosmiddel en de cuvet wordt weggenomen. Gebruik cuvetten die passen bij het golflengtegebied en houd het optische vlak schoon en vingerafdrukvrij. Houd de absorptie binnen het lineaire bereik, doorgaans onder ongeveer 1,0 tot 1,5. Werk met een ijklijn of standaardadditie, en controleer de golflengte- en absorptiejuistheid van het instrument volgens uw kwaliteitssysteem; het verschil tussen kalibreren en verifiëren staat in kalibratie versus verificatie.
Houd er rekening mee dat een spectrum ruis bevat. De verhouding tussen signaal en ruis bepaalt hoe laag u kunt meten; zie signaal-ruisverhouding en detectielimiet en kwantificeringslimiet. Troebele monsters verstrooien licht en geven een te hoge absorptie; daarvoor is turbidimetrie en nephelometrie een geschikte meetmethode. Referentiespectra en spectrale databases worden onder meer door het Amerikaanse instituut NIST beschikbaar gesteld.
De nauwkeurigheid hangt af van de techniek, het instrument en de voorbereiding. UV/Vis-metingen in het lineaire bereik met een goede ijklijn zijn nauwkeurig en reproduceerbaar; de voornaamste fouten komen van een verkeerde blanco, een verontreinigde cuvet, een monster buiten het lineaire bereik en van strooilicht. Voor elementbepalingen met AAS of ICP gelden eigen kwaliteitscontroles. Algemene richtlijnen voor het valideren van een methode staan in het artikel over validatie van analytische methoden.
Voor spectroscopisch werk levert Labvakhandel onder meer spectrometers en spectrofotometers, cuvetten van glas, kunststof cuvetten en maatglaswerk voor het bereiden van standaardoplossingen. Neem contact op voor advies over de juiste combinatie voor uw toepassing.
Onderdeel van: Voedingslaboratorium · Milieulab · Farmaceutisch lab
Geschreven door Labvakhandel, specialist in laboratoriumbenodigdheden voor bedrijven en instellingen.
Disclaimer: De informatie in dit artikel is bedoeld als algemene technische toelichting. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl aanvaardt geen aansprakelijkheid voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische, klinische of industriële situaties. Raadpleeg voor uw eigen toepassing altijd de geldende normen, vakliteratuur en de documentatie van fabrikant en apparatuur.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
